缓激肽对氧化应激反应诱导的心肌细胞衰老影响的临床研究

黄　琳

(四川省资阳市第一人民医院心内科，四川 资阳 641300)



缓激肽对氧化应激反应诱导的心肌细胞衰老影响的临床研究

黄琳

(四川省资阳市第一人民医院心内科，四川 资阳 641300)

摘要：目的分析缓激肽对氧化应激反应诱导的心肌细胞衰老的影响。方法通过细胞培养的方法进行研究，将氧化应激反应诱导的衰老的心肌细胞按照处理方法不同分为3组：正常细胞组、缓激肽组和对照组，各35个心肌细胞数。其中正常细胞组未加入过氧化氢对细胞进行诱导，单纯加入缓激肽；缓激肽组将缓激肽加入由过氧化氢氧化诱导的衰老的H9C2细胞；对照组单纯接受过氧化氢诱导的H9C2细胞，未加入缓激肽。结果随着缓激肽的浓度增加，衰老细胞的个数呈现下降的趋势，不同浓度缓激肽之间衰老细胞对比差异有统计学意义(P<0.01)。正常细胞组细胞衰老率显著低于缓激肽组和对照组(P<0.01)，缓激肽组细胞衰老率显著低于对照组(P<0.01)。3组Oliver尾含量比较差异有统计学意义(P<0.01)，缓激肽组Oliver尾含量显著低于对照组(P<0.01)，但高于正常细胞组(P<0.01)。结论缓激肽能够有效保护由氧化应激反应诱导的心肌细胞的衰老，能够抑制氧化应激反应对心肌细胞DNA的损伤程度。

关键词：缓激肽；氧化应激反应；心肌细胞；衰老

缓激肽是激肽的一种，主要存在于组织激肽释放酶-激肽系统中。组织激肽释放酶-激肽系统存在于人体和动物的各种组织内，通过信号通道而产生各种的生物学作用[1-3]，参与器官的功能调节以及各种病理和生理过程，对心血管疾病、肝肾系统以及神经系统等有较大意义的调节作用。可组织激肽释放酶-激肽系统参与机体中细胞的增殖、凋亡等过程。其中缓激肽是不同激肽释放酶作用下的不同产物，是在生理化学条件下的主要激肽类物质[4]。同时缓激肽也参与血管收缩调节，属于血管舒张因子，可以参与小动脉的扩张调节，使动脉局部血流增加，提高血管通透性，起到降压的作用，因此对心血管疾病有一定的调节和药理作用。细胞衰老是指细胞生长出现停滞，具有不可逆性和永久性[5-7]。出现衰老状态的细胞在形态学上会出现改变，包括细胞中的核膜出现内折，细胞组织的脆性增加，细胞皱褶缩小，细胞器显著性减少。其中心肌细胞衰老与心脏衰竭之间存在一定的关系。而缓激肽对机体内部的氧化应激反应有一定的调节作用，而氧化应激反应的程度影响细胞的衰老速度和过程。本研究主要观察缓激肽对受氧化应激反应诱导的心肌细胞衰老的调节作用。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料将通过氧化应激反应诱导的衰老的心肌细胞(杰兰尔上海科研体外第三方检测公司销售的美国ATCC细胞库)按照处理方法的不同分为3组：正常细胞组、缓激肽组和对照组，各35个心肌细胞数。

1.2仪器和试剂仪器：细胞培养箱，低速离心仪，普通倒置显微镜，洁净工作台，酶标仪，DNA浓度测定仪，冰箱，微量加样器。试剂：DMEM培养液，HOE140和L-NAME(均购自美国Sigma公司)，胎牛血清(由美国GIBCO公司提供)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，彗星电泳法试剂盒。单克隆小鼠抗β-actin抗体和多克隆兔抗p21抗体(均购自美国Santa Cruz公司)。

1.3方法对照组：将心肌细胞(H9C2)在培养瓶中培养，待其传代至12代后，更换含有0.5%的胎牛血清的高糖DMMEM的培养液中进行培养，再换用不含胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养。培养液中放置不同浓度的过氧化氢，使H9C2心肌细胞出现不同程度的DNA损伤以及衰老。约2 h后，即可将细胞从培养液中提取，并且用磷酸缓冲液进行洗涤，一般需要将细胞用磷酸缓冲液洗涤3次，再将细胞加入DMEM培养液中进行培养。缓激肽组：在对照组细胞培养的基础上，加入缓激肽对细胞进行干预，首先需将HOE-140以及L-NAME加入培养液中与细胞混合，约5 min后加入缓激肽。约30 min后加入过氧化氢再培养2 h。正常细胞组：不加入过氧化氢，只加入缓激肽。操作同上。

为了观察不同浓度的缓激肽对H9C2细胞衰老程度的影响，将H9C2细胞分别置于不同浓度的过氧化氢溶液中2 h，滤去培养液，将其更换至新的培养液中，继续培养3 d后，用衰老相关性β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法以及胱天蛋白酶3活性检测试剂盒等方法检测细胞活性，观察细胞的衰老情况以及其凋亡的情况等，经染色的衰老细胞呈绿色。

另外，将接受缓激肽干预后的H9C2细胞用磷酸缓冲液进行洗涤后以离心半径15 cm,600 r/min离心15 min，彗星实验观察心肌细胞的DNA损伤程度。

1.4观察指标采用SA-β-gal染色法在显微镜下观察细胞个数。对于DNA损伤程度的分析则采用CASP软件测定Olive尾含量，以确定DNA的损伤程度。

2结果

2.1不同浓度的缓激肽对心肌细胞的影响不同浓度的缓激肽干预心肌细胞后，衰老细胞在显微镜下的数据显示，随着缓激肽的浓度增加，衰老细胞的个数呈现下降的趋势，差异有统计学意义(χ2=5.926，P<0.01)，见表1。

表1　不同浓度的缓激肽对心肌细胞的影响

2.2缓激肽对氧化应激反应诱导心肌细胞衰老情况影响正常细胞组细胞衰老率显著低于缓激肽组和对照组(χ2=8.741，44.947，P<0.01)，缓激肽组细胞衰老率显著低于对照组(χ2=7.305，P<0.01)；缓激肽组p21光密度比值显著低于对照组(t=5.302，P<0.01)，缓激肽组和对照组p21密度值高于正常细胞组(t=3.751，6.021，均P<0.05)。见表2。

表2　缓激肽对氧化应激反应诱导心肌细胞衰老情况影响

a与正常细胞比较，P<0.05；b与缓激肽组比较，P<0.05

2.3DNA损伤程度3组Oliver尾含量的比较差异有统计学意义(P<0.01)，正常细胞组未加入过氧化氢，其Oliver尾长度最短。而缓激肽组Oliver尾含量显著低于对照组(t=7.026，P<0.01)，但高于正常细胞组(t=10.583，P<0.01)，对照组含量高于正常细胞组(t=7.963，P<0.01)。见表3。

表3DNA损伤程度比较

组别心肌细胞数Oliver尾含量 正常细胞351.5±0.2 缓激肽组351.9±0.1a 对照组 352.1±0.1ab F2.402 P<0.01

a与正常细胞比较，P<0.05；b与缓激肽组比较，P<0.05

3讨论

内皮细胞衰老是一种不可逆的且具有细胞周期依赖性的过程，导致人体内皮细胞衰老的原因主要是由于DNA受到损伤。其中以氧化应激反应对细胞的DNA损伤较大。衰老或者损伤的细胞会导致机体释放一系列的收缩因子和炎性因子，导致出现各种临床症状，如高血压，心力衰竭或者动脉粥样硬化等疾病。缓激肽属于组织激肽释放酶-激肽系统中的一种激肽。激肽主要是通过两个途径在人体体内以局部激素的形式结合缓激肽的受体对相邻细胞等发挥作用。缓激肽主要有β1和β2两种受体[8]。目前的研究发现，β2受体在正常机体中可以发现并存在，其表达较多，一般对赖氨酸缓激肽和缓激肽等较为敏感。由于β2受体负责调解和介导心血管效应，体内电解质的代谢情况以及对器官等保护功能，缓激肽对于以上的生理作用具有一定的临床意义。本研究主要以H9C7细胞模拟心肌细胞，过氧化氢模拟机体氧化应激反应，观察加入缓激肽干预后，细胞的衰老情况以及相关DNA的损伤程度等。本研究结果显示，缓激肽在氧化应激反应下诱导的心肌细胞具有一定的保护作用，能够有效减少衰老细胞的个数以及降低氧化应激反应对心肌细胞的DNA损伤程度，从而能够有效延缓心肌细胞的衰老程度。缓激肽对于心肌细胞延缓衰老具有临床研究的价值。缓激肽在心血管中具有不可替代的作用，其主要的生理调节作用包括扩张血管以及调节血压，保护心肌发生缺血以及降低再灌注后对心肌的损伤，延缓心力衰竭的病情进展。另外，缓激肽还具有对心脏结构变化的影响，由于缓激肽具有降低血压以及增强心肌收缩力的作用，能够缓解心肌纤维化的速度和程度，而起到影响心脏结构变化的作用[9]。

大量的研究表明，组织激肽释放酶-激肽系统在各种心血管病发病机制中具有较为重要的临床作用。另外，特异性受体是目前靶向药物的研究热点，了解组织激肽释放酶-激肽系统中各个激动剂和抑制剂的作用能够有助于各种疾病的临床治疗，特别是缓激肽的研究。对于相关的靶向药物的研究能够研发新一代的具有更高选择性的靶向药物，在治疗心血管疾病，疼痛以及细胞衰老等方面能够有突破性的进展。缓激肽对于氧化应激反应诱导而出现的心肌细胞衰老等保护作用应该予以足够的重视和研究，有助于临床上相应药物和治疗方案的研发和制订。

参考文献

[1]李耕.缓激肽对氧化应激诱导的心肌细胞衰老的影响及其机制[D].武汉：华中科技大学,2011.

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[3]田海涛,曹芳英,朱智明，等.心血管疾病不容忽视的问题:血管内皮细胞损伤[J].转化医学杂志,2013,2(3):173-177.

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[5]曹步清.组织激肽释放酶-激肽系统及其与心血管疾病的关系[J].检验医学与临床,2012,9(21):2731-2733.

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[8]骆莹莹,姚树桐,王大新，等.氧化应激在动脉粥样硬化发生发展中作用的研究新进展[J].中国介入心脏病学杂志,2013,21(1):46-50.

[9]丛军,高弼虎.解偶联蛋白生理功能和调节、周转的研究新进展[J].临床荟萃,2012,27(18):1649-1653.

Clinical Study on the Effect of Bradykinin on Oxidative Stress-induced Myocardial Cell Aging

HUANGLin.

(DepartmentofCardiology,ZiyangFirstPeople′sHospital,Ziyang641300,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the effect of bradykinin on oxidative stress-induced myocardial cell aging.MethodsCultured samples of oxidative stress-induced aging myocardial cells were divided into normal cells group,bradykinin group and control group,with 35 myocardial cells in each group.Cells in normal cells group were not induced by hydrogen peroxide but singly by bradykinin;bradykinin was added to the aging H9C2 cells in bradykinin group induced by hydrogen peroxide;and H9C2 cells in control group were singly induced by hydrogen peroxide,without adding bradykinin.ResultsWith increasing concentrations of bradykinin,the number of aging cells showed a downward trend,differences of the aging cell numbers between different concentrations of bradykinin were statistically significant(P<0.01).The aging rate of cells in normal cells group was significantly lower than those of bradykinin group and control group(P<0.01);aging rate of cells in bradykinin group was significantly lower than the control group(P<0.01).Differences of Oliver ending contents between either two of three groups were statistically significant(P<0.01), Oliver ending content of bradykinin group was significantly lower than the control group(P<0.01),while higher than normal cells group(P<0.01).ConclusionBradykinin can effectively protect the oxidative stress-induced myocardial cell from aging,and inhibit the DNA damage to myocardial cells caused by oxidative stress.

Key words:Bradykinin; Oxidative stress; Myocardial cells; Aging

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.03.064

中图分类号：R453

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)03-0546-02

收稿日期：2014-01-24修回日期：2014-07-15编辑：伊姗