香烟烟雾提取物对外周血内皮祖细胞衰老的影响及其机制研究

郑浩　李占鲁　孔旭钢　沈啸华　傅国胜

[摘要]目的观察香烟烟雾提取物（CSE）对外周血内皮祖细胞（EPC）衰老的影响，探讨其司能机制。方法 密度梯度离心法获取人外周血单核细胞，培养4d后，收集贴壁细胞，分别加入2.5%，5%，10%和15%的CSE干预。采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞；MIT比色法检测EPC的增殖能力；端粒重复序列扩增法（TRAP）.ELIsA定量检测EPC端粒末端转移酶活性；逆转录PCR法检测人端粒酶逆转录因子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA水平；Western蛋白印迹检测EPC Akt Ser磷酸化水平。结果CSE能显著增加SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量，15%CSE影响最为明显，同时显著抑制EPC增殖能力；CSE能显著抑制端粒酶活性及hTERT mRNA表达；另外，CSE能抑制EPCAkt磷酸化。结论CSE诱导EPC衰老，伴随EPC增殖能力的损害，提示细胞衰老也许是CSE影响EPC功能的机制之一；CSE诱导EPC衰老可能与抑制EPC端粒末端转移酶活性、减少hTERT mRNA表达及抑制Akt磷酸化有关。

[关键词]香烟烟雾提取物；内皮祖细胞；衰老；端粒末端转移酶

中图分类号：R446.6 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2016）05-0348-03

自1977年Asahara及其同事第一次提出内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）以来，越来越多的证据显示EPC在缺血组织的血管新生中扮演的重要作用。香烟烟雾中含有超过4000多种有毒物质。香烟烟雾提取物（cigarette smoking extract，CSE）几乎包含了香烟中所有的成分，如尼古丁、焦油等。研究显示，长期吸烟可以明显下降外周血EPC的数量及功能，后者与心血管危险因素的发生有密切关系，甚至发现吸烟者的EPC在培养早期就出现大量死亡。但是吸烟致EPC功能损伤的具体机制尚不明确。细胞的增殖能力受细胞分化及衰老所调控。最近的研究表明，EPC数量减少、功能减退与细胞衰老有关。细胞衰老的机制尚不十分清楚，目前认为端粒末端转移酶活性与细胞衰老关系密切。本研究利用体外培养人外周血单核细胞源的EPC，观察不同浓度的CSE对EPC增殖功能的影响，进一步探讨CSE对EPC衰老的影响及其可能机制。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂：人纤维连接蛋白（human fi-bronectin，HFN）购自Chemicon公司；淋巴细胞分离液购自Cedarlane公司；EGM-2MV购自Clonetic公司；二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自华美生物工程公司，进口分装；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Senescenceβ-Galactesidase Staining Kit）购自Biovision公司；TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒购自Roche公司；Trizol购自Invitrogen公司；抗phospho-Akt-Ser473单克隆抗体、抗Akt单克隆抗体购自Cell Signalling Technology公司。

1.2方法：

1.2.1 EPC分离、培养：取健康、非吸烟成人空腹外周血20ml，密度梯度离心法获取单核细胞（MNCs）。将MNCs接种于HFN包被的培养板。EGM-2 MV培养基（含EBM-2，5%胎牛血清及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、维生素、抗生素）培养4d，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养至7d，PBS洗掉非贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。贴壁细胞随机分为5组：（1）对照组：含5%胎牛血清的EGM-2MV培养基（含EBM-2及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、维生素、抗生素）；（2）香烟烟雾提取剂各浓度组（共4组）：加入2.5%，5%，10%及15%CSE干预。

1.2.2香烟烟雾提取物制备：参照Carp和Janoff方法并改良，将一支去过滤嘴香烟连于一个连续抽吸驱动装置，每支烟吸5min，一共抽吸两支香烟。吸入的烟雾经过真空容器的一个入口通入50ml的EBM培养液中制成悬液，悬液用NaOH调至pH 7.4，经0.22um微孔滤膜（购自Millipore公司）过滤做为CSE原液。配置好的CSE于30min之内用于实验。CSE原液加入含EPC的培养液中稀释成所需浓度。10%的CSE作用大致相当于每天吸入30支香烟。

1.2.3细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色：在EPC培养7d后，加入各浓度的CSE干预24h，再进行SA-β-半乳糖苷酶染色。按照试剂盒提示说明书操作，镜下观察，计数200个细胞，确定蓝色细胞百分比。

1.2.4增殖能力检测：在培养第7d消化细胞、计数，采用MTF方法检测EPC增殖能力。

1.2.5 TRAP-PCR-ELISA法检测端粒末端转移酶活性：在EPC培养7d后，加入各浓度的CSE干预24h，按照TRAP-PCR-ELISA法进行端粒末端转移酶活性测定。

1.3统计学处理：所有数据采用SPSSl0.0版统计学软件分析，计量资料以（x±s）表示，组间资料比较采用ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CSE对EPC衰老相关β-半乳糖苷酶染色、抑制EPC增殖能力、EPC端粒末端转移酶活性的影响：我们之前的研究显示，刚分离获得的单个核细胞是圆形的，体积较小，悬浮于培养液中。培养7d后形成了梭形的内皮样细胞。用FITC-UEA.T和acLDL-Dil对细胞染色后，通过共聚焦显微镜鉴定，UEA.T和DiLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC。流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志，即VEGFR2，CD34和AC133的表达以进一步确定为分化中的EPC。结果显示，加入CSE与EPC培养24h后，可以明显增加SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量。其作用呈明显的剂量相关性，与对照组相比，15% CSE作用最为显著。CSE诱导EPC衰老，我们进一步观察CSE是否能影响EPC增殖能力。MTF法检测发现，CSE在诱导EPC凋亡的同时可以显著抑制EPC的增殖功能。CSE加入EPC培养24h后抑制EPC端粒末端转移酶活性，其作用呈明确的剂量相关性，见表1。

2.2 CSE对EPC human telomerase reverse transcriptase（hTERT）mRNA表达的影响：为了观察CSE对EPChTERTmRNA表达的影响，将不同浓度的CSE加入EPC培养6h，半定量RT-PCR结果显示，CSE能显著抑制hTERT mRNA的表达，呈明显的量效关系，在15%的浓度时最为明显，见图1。

2.3 CSE对EPC Akt活性的影响：最近研究表明Akt在调节细胞衰老和端粒酶活性中扮演重要角色，因此，我们观察了CSE对EPC活性的影响。Western蛋白印迹结果显示，加入不同浓度CSE分别培养15min后，磷酸化Akt的表达随CSE浓度的增加而显著减少，在15%时达到最大效应。

3讨论

本研究发现，CSE可以诱导体外培养EPC的衰老，伴随着其增殖能力的降低。大量的研究显示，EPC衰老与EPC数量减少和功能损害有关。长期吸烟可以明显下降外周血EPC的数量及功能，本研究为该现象提供了一定的分子学机制。在细胞分子水平上，染色体末端端粒的损耗是衰老的重要机制，端粒丢失最终可造成细胞衰老直至凋亡。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶，能以自身RNA为模板合成端粒DNA并添加到染色体末端，延长真核细胞染色体端粒。因此端粒酶活性缺乏可造成端粒长度的缩短从而诱导细胞衰老。大量研究显示，各种心血管危险因子可以降低大鼠或人外周血EPC端粒长度及端粒酶活性，同时能增加衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞比例。我们之前研究亦发规基质细胞衍生因子1α延缓EPC的衰老可能与端粒酶活动增加及端粒长度延长有关。因此，我们推断EPC衰老可能与端粒端粒酶有关。

hTERT mRNA的表达和端粒酶的活性具有很强的关联性。我们近期的研究亦显示，基质细胞衍生因子1α抑制EPC衰老及促进缺血组织再内皮化与其促进hTERT mRNA表达有关。本研究显示，CSE能降低EPC端粒酶活性，同时亦能抑制EPC hTERTmRNA的表达，据此我们推测CSE诱导EPC衰老可能与其抑制EPC端粒酶活性及抑制hTERT mRNA的表达有关。细胞衰老机制除了端粒学说（即复制下衰老）之外，尚有非端粒学说，后者包括氧自由基学说及DNA损伤学说。香烟烟雾中包含了4000多种物质，其中就包括大量的自由基和氧化剂。吸烟导致NO合成减少、EPC功能损伤与氧化应激有关。因此，CSE诱导EPC衰老的相关机制尚需进一步研究。