启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌Eca9706细胞增殖和凋亡的影响

尹素改,王慧慧，吴耀松，陈玉龙



启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌Eca9706细胞增殖和凋亡的影响

尹素改,王慧慧，吴耀松，陈玉龙

目的 探讨启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌Eca9706细胞增殖和凋亡的影响。方法 按沙参∶丹参∶茯苓∶川贝母(去心)∶郁金∶砂仁壳∶杵头糠=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1的比例配制启膈散，每克药物配10 ml的比例加入95%乙醇溶液，用旋转蒸发仪浓缩药液，浓缩液与乙酸乙酯按体积比2∶1进行萃取，获取启膈散乙酸乙酯提取物。Eca9706细胞与浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的启膈散提取物共培养，MTT法检测启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率。Eca9706细胞与35%抑制浓度(IC35)、50%抑制浓度(IC50)和70%抑制浓度(IC70)的启膈散提取物共培养，采用流式细胞仪检测启膈散提物对Eca9706细胞的凋亡率。结果 不同浓度启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率与启膈散提取物浓度拟合曲线方程为Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185,R2=0.996,概率法计算IC35为22.8 μg/ml，IC50为81.8 μg/ml，IC70为162.2 μg/ml。显微镜下观察，随着启膈散提取物浓度的增加，细胞变圆、变小，贴壁细胞数目逐渐减少，细胞间隙增大，细胞碎片增多。IC35、IC50和IC70启膈散提取物对Eca9706细胞的凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.001)。激光共聚焦显微镜下显示，启膈散提取物作用于Eca9706细胞后，部分细胞膜呈绿色，提示早期凋亡；部分细胞膜呈绿色，且细胞核呈红色，细胞体积变小、变圆，形成凋亡小体，提示晚期凋亡细胞。结论 启膈散乙酸乙酯提取物可抑制食管癌Eca9706细胞增殖，诱导细胞凋亡。

食管肿瘤；启膈散；细胞增殖；Eca9706细胞；细胞凋亡

尹素改,王慧慧，吴耀松，等.启膈散乙酸乙酯提取物对食管癌Eca9706细胞增殖和凋亡的影响[J].中国全科医学，2015，18(14)：1663-1666.[www.chinagp.net]

Yin SG,Wang HH,Wu YS，et al.Effect of qigesan extracted by ethyl acetate on the proliferation and apoptosis of eca9706 cell in esophageal neoplasm[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1663-1666.

食管癌每年新发患者48万例，预后较差，5年生存率低于15%[1-2]。食管癌属中医“噎膈”范畴，启膈散是《中医内科学》等书收载的治疗食管癌(噎膈)的首选方剂[3]。该方可通过磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)介导的信号转导通路抑制食管癌细胞生长，通过Caspase-3介导的细胞凋亡信号诱导癌细胞凋亡，可不同程度地抑制EGFR、PKCα、MARCKS、PI3K、AKT-1和NF-κBp50蛋白的表达，抑制肿瘤血管生成及免疫调节作用。有研究已发现，本方水煎剂对食管癌细胞有一定抑制作用，但用量较大[4-5]。为提高该方抑制肿瘤效果，对其进行分部位提取，本研究观察了该方乙酸乙酯提取物对食管癌细胞增殖、细胞凋亡的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 启膈散参照《医学心悟》组方，药物组成与比例为沙参∶丹参∶茯苓∶川贝母(去心)∶郁金∶砂仁壳∶杵头糠=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1；药材均购自北京同仁堂(集团)有限责任公司，并经河南中医学院苗艳艳副研究员鉴定为真品。

1.1.2 细胞及试剂 人食管癌细胞株Eca9706细胞为河南中医学院分子生物实验中心保存；MTT和胰酶购自索莱宝生物科技有限公司，批号：20131113；RPMI 1640培养基购自索来宝生物科技有限公司，批号：20131012；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：121005；Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kits 购自南京凯基生物科技发展有限公司，凋亡试剂盒批号：20131226。

1.1.3 仪器 细胞培养箱(德国Heraeus)，倒置显微镜(德国Carl Zeiss Jena)，BioMate紫外线分光光度计(美国Thermo Scientific)，SG-603生物安全柜(美国Bake)，ELx800型酶标仪(美国BIO-TEK)，FV1000S-LX81激光共聚焦显微镜(日本Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 药物提取 按上述比例称取药物，以每克药物配10 ml的比例加入95%乙醇溶液浸泡7 d，震荡2次/d，混匀。用旋转蒸发仪浓缩药液，浓缩液与乙酸乙酯按体积比为2∶1进行萃取，浓缩、低温真空干燥、刮药、称重，出膏率为0.82%(最终提取出的膏状药物重量与药物用量比值)。二甲基亚砜(DMSO)充分溶解，配置成100 mg/ml的母液，0.22 μm过滤除菌，-20 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养人食管癌细胞株Eca9706细胞，2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3 MTT法检测启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率 将Eca9706细胞以细胞密度104个/孔接种于96孔板中(96孔板周边孔弃去不用，加无菌磷酸盐缓冲液填充)，每孔加200 μl细胞悬液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育24 h。弃去培养液，分别加入浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的启膈散提物100 μl。细胞培养48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 15 μl，继续培养4 h，吸去上液，每孔加入DMSO 150 μl，轻轻振荡后用酶标仪检测，570/630 nm处测各孔吸光度(OD)值，计算启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率，抑制率=(对照OD值-待测OD值)/对照OD值×100%，重复4次。

1.2.4 流式细胞仪检测启膈散提取物对Eca9706细胞的凋亡率 Eca9706细胞以细胞密度105个/孔接种于培养皿中,培养24 h后，分别加入含35%抑制浓度(IC35)、50%抑制浓度(IC50)和70%抑制浓度(IC70)启膈散提取物的RPMI 1640培养液,对照加RPMI 1640培养液与溶解药物等量的DMSO,细胞培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞，4 ℃磷酸盐缓冲液冲洗，300×g离心5 min，计数105个细胞于流式管中，加结合液Buffer重悬细胞，后加Annexin V-FITC，避光10 min，后加PI避光5 min，1 h内采用流式细胞仪进行检测,分别采用Cellquest软件、Modfit LM软件获取、分析数据，重复4次，记录凋亡率(可被Annexin V-FITC染色的细胞占流式细胞仪读取总细胞数的比例)。

1.2.5 激光共聚焦检测凋亡小体 Eca9706细胞以细胞密度105个/孔接种于激光共聚焦专用的小培养皿中,培养24 h后，加入含IC35、IC50和IC70启膈散提取物的RPMI 1640培养液,对照加RPMI 1640培养液与溶解药物等量的DMSO,细胞培养48 h后，吸去培养液,用磷酸盐缓冲液冲洗两次，加500 μl的Buffer，后加Annexin V和异硫氰酸荧光素(FITC)，避光10 min，后加PI避光5 min，激光共聚焦显微镜检测，Viewer软件分析图片。

2 结果

2.1 启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率 不同浓度启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率比较，差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。启膈散提取物对Eca9706细胞的抑制率与启膈散提取物浓度拟合曲线方程为Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185,R2=0.996,应用概率法计算IC35为22.8 μg/ml，IC50为81.8 μg/ml，IC70为162.2 μg/ml(见图1)。

Table 1 Comparison of Eca9706 cell inhibition rates among qigesan extractives of different concentrations

浓度OD值抑制率(%)对照1.18±0.23-启膈散提取物12.5μg/ml0.89±0.2125±6 启膈散提取物25.0μg/ml0.77±0.1635±8 启膈散提取物50.0μg/ml0.62±0.1047±12* 启膈散提取物100.0μg/ml0.43±0.0363±8*△ 启膈散提取物200.0μg/ml0.31±0.0373±11*△▲F值-19.021P值-<0.001

注：-为无此数据；与启膈散提取物12.5 μg/ml比较，*P<0.05；与启膈散提取物25.0 μg/ml比较，△P<0.05；与启膈散提取物50.0 μg/ml比较，▲P<0.05

2.2 细胞形态学改变 显微镜下观察，正常Eca9706细胞呈椭圆形、多边形、铺路石样贴壁生长，胞质饱满，典型的上皮细胞形态；随着启膈散提取物浓度的增加，细胞变圆、变小，贴壁细胞数目逐渐减少，细胞间隙增大，细胞碎片增多(见图2)。

图1 不同浓度启膈散提取物与Eca9706细胞抑制率的关系

Figure 1 Relation between Eca9706 cell inhibition rates and qigesan extractives of different concentrations

注：A为对照，B为IC35启膈散提取物，C为IC50启膈散提取物，D为IC70启膈散提取物

图2 不同浓度启膈散提取物对Eca9706细胞形态的影响(×100)

Figure 2 Effects of qigesan extractives of different concentrations on the form of Eca9706 cells

2.3 启膈散提取物对Eca9706细胞的凋亡率 IC35、IC50和IC70启膈散提取物对Eca9706细胞的凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.001，见表2)。

2.4 凋亡小体 激光共聚焦显微镜下显示，启膈散提取物作用于Eca9706细胞后，部分细胞膜呈绿色，提示早期凋亡；部分细胞膜呈绿色，且细胞核呈红色，细胞体积变小、变圆，形成凋亡小体，提示晚期凋亡细胞。与对照比较，IC50启膈散提取物造成Eca9706细胞早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量明显增多(见图3)。

Table 2 Comparison of Eca9706 cell apoptosis rates among qigesan extractives of different concentrations

浓度凋亡率(%)对照1.35±1.13 IC35启膈散提取物7.92±1.24* IC50启膈散提取物12.65±1.21*△ IC70启膈散提取物20.26±1.18*△▲F值151.967P值<0.001

注：与对照比较，*P<0.05；与IC35启膈散提取物比较，△P<0.05；与IC50启膈散提取物比较，▲P<0.05

注：A为对照的明场，B为对照的荧光，C为IC50启膈散提取物的明场，D为IC50启膈散提取物的荧光

图3 激光共聚焦显微镜检测结果(×400)

Figure 3 Results of laser confocal microscope test

3 讨论

食管癌属中医“噎膈”范畴，痰气交阻是噎膈发生的主要病机，痰气交阻证是其最常见证候之一。在1979年1月—2011年12月中国知网(CNKI)收录的有关中医诊治食管癌的223篇文献中，痰气交阻证占13个食管癌证型的19.7%(14/71)[6]。启膈散是行气化痰法治疗食管癌的代表方剂，是清代名医程钟龄《医学心悟》中为治疗噎膈而创制，原书说本方：“通噎膈，开关之剂，屡效。”

本方水煎剂对食管癌细胞有一定抑制作用，但用量较大[4-5]。为提高该方抑制肿瘤效果，对其进行分部位提取。本研究发现，启膈散乙酸乙酯部位可有效抑制食管癌细胞增殖(IC50=81.8 μg/ml)，促进细胞凋亡。临床启膈散只以水煎剂应用，会丢失很多有效成分。因此，有必要结合现代药理药效学指标对启膈散的提取工艺进行深入研究。

逃脱细胞死亡是癌的特性之一，其中凋亡是死亡的主要形式，发挥对肿瘤发展的天然限制作用。但肿瘤细胞可以许多策略减弱或绕过凋亡，如失去TP53的肿瘤抑制功能、增加抗凋亡调节因子的表达，在肿瘤发展成为高恶性及耐受治疗过程中发挥重要作用[7]。对此，有研究发现许多天然药物提取物可通过干预细胞凋亡起到抑制肿瘤作用[8]。本研究通过激光共聚焦显微镜观察到，Eca9706细胞经启膈散乙酸乙酯提取物作用后发生早期和晚期凋亡现象。

综上所述，启膈散乙酸乙酯提取物可抑制食管癌Eca9706细胞增殖，诱导细胞凋亡，但其作用分子机制有待进一步研究。

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(本文编辑：吴立波)

Effect of Qigesan Extracted by Ethyl Acetate on the Proliferation and Apoptosis of Eca9706 Cell in Esophageal Neoplasm

YINSu-gai,WANGHui-hui,WUYao-song，etal.

MolecularBiologicalExperimentCenter,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046,China

Objective To investigate the effect of qigesan extracted by ethyl acetate on the proliferation and apoptosis of Eca9706 cell in esophageal neoplasm.Methods Qigesan used in the study was confected by the set recipe(adenophora stricta∶red sage root∶poria cocos∶fritillaria cirrhosa with core removed∶curcuma aromatic∶fructus amomi shuck∶rice bran=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1).With the proportion of 1 gram of qigesan/ 10 ml ethanol solution,qigesan was mixed with 95% ethanol solution.A rotary evaporator was used to concentrate the mixed liquor.After mixing the concentrated liquor with ethyl acetate as the volume ratio of 2∶1,we got the finished qigesan extractive.Eca9706 cells was co-cultured with the extractives of 12.5,25.0,50.0,100.0 and 200.0 μg/ml concentrations,and MTT method was used to test the inhibition ratios of Eca9706 cells caused by the extractives of different concentrations.Then Eca9706 cells were co-cultured with the extractives of 35% inhibition concentration (IC35),50% inhibition concentration (IC50) and 70% inhibition concentration (IC70),and flow cytometry was employed to test the apoptosis rates of Eca9706 caused by the extractives.Results Qigesan extractives of different concentrations induced different (P<0.05) inhibition ratios of Eca9706 cells.The curve-fitting equation for inhibition ratios of Eca9706 cells and the concentrations of qigesan extractives was Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185(R2=0.996).After calculating by the equation,we found that the concentrations for IC35,IC50 and IC70 were 22.8 μg/ml，81.8 μg/ml and 162.2 μg/ml respectively.Through a microscope,we observed that,as the concentration of qigesan extractives increasing,Eca9706 cells became rounder and smaller,the amount of adherent cells decreased,the intercellular space expanded and the cell debris increased.IC35,IC50 and IC70 extractives caused significantly different (P<0.001) apoptosis rates of Eca9706 cells.Through a laser scanning confocal microscope,we noted that,with the influence of qigesan extractives,some Eca9706 cells turned green,which suggested early apoptosis,and some Eca9706 cells turned green in cytomembrane and red in cell nucleus with shrinking volume and rounder shape,which suggested apoptotic body and late apoptosis.Conclusion Qigesan extractive could significantly inhibit the proliferation of Eca9706 cells and induce Eca9706 cell apoptosis.

Esophageal neoplasms;Qigesan； Cell proliferation； Eca9706 cell； Apoptosis

国家自然科学基金面上项目(81173177)；河南省高等学校重点科研项目(15A310020)

450046河南省郑州市，河南中医学院科研处分子生物实验中心

陈玉龙，450046河南省郑州市，河南中医学院科研处分子生物实验中心；E-mail：cyl172621@163.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.015

2014-11-25；

2015-04-02)