Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达

雷明，赵美眯，封瑞，王红梅，毛楠，朱彤，郝丽英

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；2.东北大学环境生物学教研室，沈阳 110004）

·论著·

Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达

雷明1，赵美眯1，封瑞1，王红梅1，毛楠1，朱彤2，郝丽英1

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；2.东北大学环境生物学教研室，沈阳 110004）

目的构建心肌Cav1.2通道CT1片段及其突变体与谷胱甘肽转移酶（GST）重组的融合蛋白原核表达载体，并进行蛋白表达和纯化。方法以豚鼠Cav1.2通道CT1质粒（pGEX-6p-3/CT1）为模板，采用定点突变技术构建CT1 T1603A和CT1 T1603D两种突变体质粒。转化大肠杆菌BL21感受态细胞，大量培养后用IPTG诱导GST融合蛋白表达，分离纯化后采用SDS-PAGE检测CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度。结果CT1片段及其突变体融合蛋白得到了正确、大量表达，提取纯化后的CT1片段及其突变体融合蛋白具有较高的纯度。结论成功构建了Cav1.2通道CT1片断及其突变体融合蛋白原核表达载体，获得了CT1突变体融合蛋白，为深入研究CT1片断在Cav1.2通道调节中的作用和机制奠定基础。

融合蛋白；CT1；突变体

电压依赖性钙通道（voltage-dependent Ca2+channel，VDCC）按照电生理特性分为低电压依赖型及高电压依赖型2种，按照药理学及生物物理学特性分为T、L、N、P/Q和R型［1，2］，其中L型钙通道（L-type Ca2+channel，LTCC）可以被二氢吡啶类药物硝苯地平所阻断，也称为二氢吡啶受体。LTCC是研究最为广泛的高电压依赖型钙通道之一，存在于大多数可兴奋细胞膜上，如骨骼肌、心脏、脑、内分泌细胞、神经元及其他组织。在心肌细胞中，L型钙通道介导的钙离子内流触发肌浆网钙释放通道ryanodine受体开放，肌浆网存储的钙离子大量释放，这种级联效应称为“钙致钙释放”（Ca-induced Ca2+release，CICR），在心脏的兴奋收缩耦联（excitationcontraction couple，EC）中起着关键性作［3］，LTCC的调节方式多种多样，异常复杂［4，5］。

前期研究［6～8］发现，钙离子、钙调蛋白（calmodulin，CaM）、钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（Ca/ calmodulin-dependent protein kinasesⅡ，CaMKⅡ）等都是通过与LTCC C末端的CT1（1 509～1 789）片段特定的氨基酸或氨基酸序列相互作用发挥调节功能。CaM可直接与心肌细胞Cav1.2钙通道CT1片段结合，从而对钙通道钙离子依赖性易化作用进行调节［9，10］，CaMKⅡ通过磷酸化CT1片段上的1 603位苏氨酸以调节钙通道的功能［11］。为了更好研究1 603位苏氨酸在Cav1.2钙通道调节中的作用，本研究以豚鼠Cav1.2通道CT1为模板，采用定点突变技术将1 603位苏氨酸分别突变为丙氨酸（CT1 T1603A）和天门冬氨酸（CT1 T1603D），模拟其去磷酸化和磷酸化状态，制备纯化蛋白并进行相应的活性鉴定，为研究Cav1.2钙通道的磷化调节奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达质粒pGEX-6p-3/CT1和BL21菌株由本实验室保存。异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、溶菌酶（1ysozvme，LYS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DDT）、N-十二烷基肌氨酸钠（N-laurylsarcosine，N-Lau）、氨苄西林（ampicillin，Amp）均购自美国Sigma公司；PreScission Pmtease和GS-4B beads购自德国GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司；其他试剂均购自美国BIOSHARP公司。CT1定点突变由本研究组提供原始质粒作为模板和突变位置信息，由上海生工生物工程股份有限公司代为完成突变和序列测定。

1.2 BL21感受态细胞的转化

应用42℃精确热激法进行感受态细胞的转化，将CT1及其突变体质粒导入BL21感受态细胞，构建相应的原核表达系统。具体方法如下：分别量取pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT1 T1603A和pGEX-6p-3/CT1 T1603D质粒各5 ng，加入到50 μL E.coli BL21感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30 min，再放入42℃水浴锅热击45 s，快速转移至冰浴中，冷却2 min。加入1 mL SOC培养基（不含抗生素），混匀后37℃、120 r/min水浴振荡培养l h。3 000 r/min、2 min离心后去除600 μL上清，剩余沉淀的菌体约轻轻混匀后加在含Amp 0.1 g/L的LB固体琼脂培养板上，无菌条件下涂抹均匀。晾干后转移至37°C电热恒温培养箱中，倒置培养12～16 h。取单克隆菌种接种于装有3 mL含Amp 0.1 g/L的LB培养液的15 mL离心管中，37℃、120 r/min培养12～16 h。菌液按菌液∶50%甘油比例为4∶1冻存于-80℃备用。

1.3 融合蛋白的诱导表达及提取纯化

各取10 μL菌种加入到装有200 mL含0.1 g/L Amp的LB培养液的锥形瓶中，37℃、120 r/min振荡培养12～16 h。当A600在0.8左右时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃、120 r/min振荡培养4 h，诱导融合蛋白表达。菌液经4 000 r/min离心8 min后弃上清，用10 mL PBS重悬细菌，加入1 mol/L LYS和1 mol/L DTT各100 μL、15%N-Lau 1 mL，混匀后放置于冰上30 min，然后用超声法粉碎细菌（超声3 s停7 s，共20 min，冰上进行）。再加入30%TritonX-100 335 μL，冰上放置30 min，充分破碎细菌释放融合蛋白。16 000 g、8 min离心后将10 mL上清液加入到含200 μL GS-4B beads的15 mL离心管，4℃旋转结合过夜（GS-4B beads用PBS洗3遍，每次800 r/min离心2 min）。第2天用PBS温柔清洗beads 3次，每次5 mL，800 r/min离心2 min，去除杂蛋白，4℃保存备用。

1.4 CT1及其突变体蛋白的鉴定

用15%SDS-PAGE电泳检测纯化的CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度。

2 结果

2.1 CT1及其突变体质粒的测序结果

DNA测序结果显示CT1及其突变体质粒均是含有843 bp的DNA片断，CT1片断中位于285 bp处的密码子ACG（图1A）分别突变为GCT（图1B）和GAC（图1C）。这3个密码子编码的氨基酸依次为苏氨酸（T）、丙氨酸（A）和天门冬氨酸（D），该位点氨基酸在Cav1.2通道氨基酸序列全长中对应为第1 603位。因此，结果表明已成功获得CT1突变体质粒CT1 T1603A和CT1 T1603D。

2.2 CT1及其突变体蛋白的表达与纯化

实验中表达提取的蛋白均为GST-CT1融合蛋白。其中，CT1片断共有281个氨基酸，分子量约为17.6 kDa，GST分子量约为26 kDa。采用15%SDSPAGE电泳检测该融合蛋白及其突变体蛋白。如图2所示：CT1及其突变体蛋白分子量大约为43.6 kDa，与理论值基本一致。表明该方法构建并表达所得的CT1及其突变体蛋白均能正常表达。

3 讨论

Cav1.2通道的磷酸化调节是其重要的调节途径之一，许多调控因子都是通过对通道的磷酸化和去磷酸化实现调节功能［12，13］。基于氨基酸序列结构，豚鼠Cav1.2通道C末端有17个潜在的磷酸化位点，其中相当一部分位于CT1片段（1 509～1 789）。Erxleben等［14］报道了CaMKⅡ磷酸化Ⅰ～Ⅱ环上的439位丝氨酸和CT1上的1 517位丝氨酸，引起兔心肌细胞Cav1.2通道2型开放。Lee等［15］也报道了CaMKⅡ磷酸化兔平滑肌钙通道C末端的1 512和1 570位丝氨酸，促进电压依赖性易化。前期研究发现，1 603位苏氨酸可以被CaMKⅡ磷酸化，并且对Cav1.2起着重要的调节作用［11］。CT1片断及其突变体的构建表达有利于进一步研究CT1上各个调节位点对Cav1.2通道的调节作用和机制，具有十分重要的意义。

图1 CT1及其突变体重组质粒的DNA测序结果Fig.1 DNA sequence identification of GST-CT1and its mutants

图2 纯化后的CT1及其突变体GST融合蛋白SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE results of purified GST-CT1and its mutants

原核表达系统发展日趋完善、操作流程简单快速、成本低、产量高，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。但在表达具体某种蛋白时，需要对表达条件进行相应的优化，以获得高纯度、高表达量的融合蛋白。本研究以豚鼠Cav1.2通道CT1为模板构建了2种突变体，采用定点突变技术将1 603位苏氨酸分别突变为丙氨酸（CT1 T1603A）和天门冬氨酸（CT1 T1603D）。这2种突变体都能正常表达GST融合蛋白，而且所表达的GST融合蛋白均能与CaM结合，其Ca2+依赖性和CaM浓度依赖与CT1相似。此方法同样适用于CT1其他位点的突变，为研究Cav1.2钙通道的磷酸化调节奠定了基础。

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（编辑 王又冬）

Plasmid Construction and Protein Expression of CT1 Fragment Mutants of Cav1.2 Channel

LEIMing1，ZHAOMei-mi1，FENG Rui1，WANGHong-mei1，MAONan1，ZHUTong2，HAOLi-ying1
（1.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Lab of Environment Biology and Engineering，Northeastern University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo construct prokaryotic expression vectors of the CT1 fragment of Cav1.2 channel and its mutants for CT1-GST fusion protein expression and purification.MethodsTaking plasmid of pGEX-6p-3/CT1 as template，two mutational plasmids（CT1-T1603A and CT1-T1603D）with site directed mutagenesis were constructed.The plasmids were then transformed to E.coli BL21 competent cells，and the transformantswere induced with IPTG forthe expression ofGSTfusion proteins ofCT1 fragmentand its mutants.SDS-PAGE was performed to determine the relative molecular weight and purity.ResultsMutated bases corresponding to the target amino acid site were confirmed by cDNA sequence.High purity of GST-CT1 fusion protein and its mutants were successfully obtained.ConclusionProkaryotic expression vectors of CT1 fragment and its mutants were constructed，and the fusion proteins were successfully expressed were obtained.These results provided a basis for further studies of the function ofCT1 fragmentin the regulation for Cav1.2 channeland its mechanism.

fusion protein；CT1；mutant

R966

A

0258-4646（2015）09-0837-03

国家自然科学基金（31071004）

雷明（1984-），男，硕士研究生.

郝丽英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2014-12-08

网络出版时间：