hSNF2H在非小细胞肺癌中存在过表达

谢玲玲，金素芬，贺佳妮，付琳，王晓荣，邢济麟，李庆昌

（1.中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110122；2.辽宁省鞍山市中心医院病理科，辽宁 鞍山 114001）

·论著·

hSNF2H在非小细胞肺癌中存在过表达

谢玲玲1，金素芬2，贺佳妮1，付琳1，王晓荣1，邢济麟1，李庆昌1

（1.中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳 110122；2.辽宁省鞍山市中心医院病理科，辽宁 鞍山 114001）

目的分析hSNF2H在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素间的关系。方法应用免疫组化、Western blot和免疫荧光的方法检测非小细胞肺癌中hSNF2H的蛋白表达情况及其与Rsf-1的共定位情况。结果免疫组化结果显示54.05%（40/74）的病例存在hSNF2H蛋白的过表达，其过表达与肺癌患者的年龄、性别及淋巴结转移无关（P分别为0.485 0、0.159 0、0.815 0），而与肺癌的TNM分期以及分化成正相关（P分别为0.002 0、0.037 0）。结论肺癌中存在hSNF2H蛋白的高表达，并与TNM分期和分化相关。

hSNF2H；Rsf-1；非小细胞肺癌；免疫组织化学；免疫荧光

hSNF2H是SWI2/SNF2家族的一个成员，它是由SMARCA5编码的一种染色质重塑蛋白［1～3］。SMARCA5包含一个由3 156个核苷酸编码的含有1 052个氨基酸的肽段的开放阅读框架。ISWI家族中hSNF2H的ATP酶结合域是高度保守的。hSNF2H与Rsf-1形成染色质重塑复合物RSF，在这个复合物中Rsf-1作为组蛋白分子伴侣调整复合物与DNA的结合活性，同时hSNF2H利用其ATP酶活性和解螺旋酶活性参与核小体的移动和DNA的解螺旋，RSF复合物动员核小体调节染色质的结构以适应各种生长信号和环境变化的需求［4～6］。已报道这种核小体的改变也发生在其他ISWI复合物和SWI/SNF复合物中，且它在转录的激活或抑制［7～9］，DNA的复制［10］，细胞周期的进展中有一定作用［12］。另外有研究报道，高hSNF2H蛋白质或mRNA水平与卵巢癌中最恶性类型密切相关，并且与卵巢癌患者的较短的生存期相关。迄今为止，越来越多的证据表明染色质重塑参与调控细胞的恶性转化和肿瘤进展。

有文献报道hSNF2H在卵巢癌中存在过表达，但是hSNF2H在非小细胞肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系未见报道。因此，本课题拟通过免疫组化、Western blot、免疫荧光双染等方法研究肺癌组织及肺癌细胞系中hSNF2H表达情况及其与临床病理因素之间的关系，为肺癌的诊断和治疗提供新的基因靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

74例非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来自2008年至2010年在中国医科大学附属第一医院行手术治疗的患者，组织经10%中性甲醛固定、石蜡包埋。患者术前均未接受放化疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色：将石蜡组织块切成4 μm厚切片，脱蜡，脱水，按S-P法说明操作。抗hSNF2H单克隆抗体（1∶1 000，Upstate，美国），DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照。2名病理诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。结果判定：hSNF2H以细胞核染色为阳性细胞。根据阳性肿瘤细胞百分比：0%记为0分，1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，76%～100%记为4分。同时根据染色强度：阴性或浅黄色记为0分，黄色记为1分，棕褐色记为2分。着色细胞数得分乘以着色强度得分为hSNF2H得分。我们将得分为4～8分记做hSNF2H高表达。

1.2.2 Western blot：收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心（4℃，12 000 r/min，15 min），提取上清为总蛋白。考马斯亮蓝法蛋白定量，上样蛋白量为60 μg。8%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜（Millipore，Bedford，美国），5%脱脂奶粉封闭，抗hSNF2H（1∶1 000，Upstate，美国），抗Rsf-1（1∶1 000，Abcam，美国）和β-actin、GAPDH（1∶1 000，Santa Cruz）4℃孵育过夜，分别与对应的二抗（1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，美国）室温孵育2 h，ECL（Pierce）显色，结果经BioImaging System（UVP Inc.，Upland，美国）采集。

1.2.3 免疫荧光实验：H1299、LTE细胞用4%多聚甲醛固定，用1%BSA封闭1 h后，hSNF2H（1∶100，Upstate，美国）抗体，Rsf-1（1∶1 000，Abcam，美国）抗体4℃孵育过夜，然后用山羊抗兔/鼠二抗罗丹明二抗孵育。细胞核采用DAPI染色，采用Radiance 2000激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Thornwood，美国）进行共聚焦扫描观察。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计分析软件，实验结果采用χ2检验进行数据分析，用表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌中hSNF2H和Rsf-1共定位于细胞核

对74例肺癌组织连续切片进行免疫组化染色，分别检测hSNF2H和Rsf-1的表达情况，发现在连续切片中，hSNF2H和Rsf-1共定位于细胞核（图1A）。然后，我们应用Western blot的方法检测了hSNF2H和Rsf-1蛋白在11种非小细胞肺癌细胞系和正常支气管上皮细胞系（HBE）中的表达水平（图1B）。我们筛选出hSNF2H高表达的2个细胞系（H1299和LTE）。进而在H1299、LTE细胞中进行免疫荧光双染实验，然后激光共聚焦证实Rsf-1和hSNF2H共同定位于细胞核（图1C）。

2.2 hSNF2H在非小细胞肺癌组织中存在过表达

采用免疫组化方法检测hSNF2H蛋白在74例非小细胞肺癌及其癌旁正常肺组织中的表达情况。hSNF2H在正常支气管上皮及肺泡上皮均为阴性表达或弱着色，而在肺癌组织中过表达。肺癌组织中的阳性表达率为54.1%（40/74）（图2）。统计学分析结果表明：hSNF2H的表达与非小细胞肺癌的高TNM分期和分化正相关（P分别为0.002 0、0.037 0，表1），但与患者的年龄、性别、病理组织学类型及淋巴结转移无关。

3 讨论

在人类癌症中，基因扩增是一种非常普遍的现象［11～14］。Rsf-1作为癌基因之一，其11q13.5区域同样也存在着基因扩增。有文献报道，在肺癌中，存在着Rsf-1基因的扩增。有研究表明Rsf-1蛋白或RNA水平的增高与卵巢癌有关，并且在卵巢癌中Rsf-1和hSNF2H是共同过表达的。所以我们推测，在非小细胞肺癌中Rsf-1和hSNF2H是否也存在着共同过表达呢？于是，我们在74例非小细胞肺癌患者的组织切片中进行了免疫组化染色，结果发现有48例存在着hSNF2H的过表达，并且hSNF2H的过表达与TNM分期和分化相关，这表明hSNF2H与肺癌的恶性行为有关。

免疫组化连续切片及荧光双染实验发现Rsf-1和hSNF2H存在共定位，并且Rsf-1和hSNF2H共定位于细胞核。

综上所述，我们的研究发现在非小细胞肺癌中存在着hSNF2H的过表达，并且hSNF2H的过表达与肺癌的高分期、低分化相关。此后，我们将进一步研究hSNF2H在肺癌中的分子机制及相关信号通路，使其成为治疗肺癌可能的新靶点。

图1 hSNF2H和Rsf-1共定位于细胞核Fig.1 hSNF2H and Rsf-1 were co-localized in the nucleus

图2 hSNF2H在非小细胞肺癌中存在过表达Fig.2 hSNF2H overexpressed in NSCLC

表1 hSNF2H与肺癌临床病理因素的关系Tab.1 Distribution of hSNF2H status in lung cancer according to clinicopathological characteristics

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（编辑 裘孝琦）

Overexpression ofhSNF2Hin Non-smallCellLung Cancer

XIE Ling-ling1，JINSu-fen2，HEJia-ni1，FULin1，WANGXiao-rong1，XINGJi-lin1，LIQing-chang1

（1.DepartmentofPathology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China；2.DepartmentofPathology，Anshan CentralHospital，Anshan 114001，China）

Objective To detectthe expression ofhSNF2H in non-smallcelllung cancer（NSCLC）and analyze the relationship between its expression and clinical pathological factors.MethodsImmunohistochemical methods，Western blot and immunofluorescence assay were employed to evaluate protein levels of hSNF2H in NSCLC.The co-localization of Rsf-1 and hSNF2H in the nucleus was determined.ResultshSNF2H expression was observed in the nuclear compartments of tumor cells，while normal lung tissues and the normal bronchial epithelia exhibited negative or weak expression.In 88 cases ofnon-smallcelllung cancertissues，hSNF2Hoverexpression（score≥4）was observed in 54.05%ofcases（40/74）. There were no statistical differences among hSNF2H overexpression and age（P=0.485 0），gender（P=0.159 0）or nodal status（P=0.815 0）. Strong hSNF2H expression correlated with differentiation（P=0.037 0）.Those patients with high hSNF2H expression had advanced stage of NSCLC（I&IIvs.III，P=0.002 0）.ConclusionThe hSNF2H protein wasoverexpressed in NSCLC.Strong hSNF2Hexpression is correlated with differentiation and the patients with high hSNF2H expression had advanced stage ofNSCLC.

hSNF2H；Rsf-1；NSCLC；immunohistochemistry；immunofluorescence

R36

A

0258-4646（2015）09-0833-04

谢玲玲（1986-），女，硕士研究生.

李庆昌，E-mail：liqingch@hotmail.com

2015-03-10

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