人肾上腺肿瘤组织中蛋白激酶Cα和血管内皮生长因子的表达及意义

王亚奇，孔垂泽，张哲，毕晓军，高小林

（中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001）

·论著·

人肾上腺肿瘤组织中蛋白激酶Cα和血管内皮生长因子的表达及意义

王亚奇，孔垂泽，张哲，毕晓军，高小林

（中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001）

目的探讨蛋白激酶Cα（PKCα）和血管内皮生长因子（VEGF）在肾上腺肿瘤、肾上腺增生组织和正常肾上腺组织中的表达情况和意义。方法应用实时定量PCR、Western blot和免疫组化技术对41例肾上腺腺瘤、25例良性肾上腺增生组织和7例正常肾上腺组织的PKCα和VEGF表达情况进行比较。结果肾上腺腺瘤中PKCα和VEGF的阳性表达高于肾上腺增生组织和正常肾上腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；肾上腺增生组织中PKCα与VEGF的表达均高于正常肾上腺组织，但两者差异无统计学意义（P＞0.05）。结论PKCα和VEGF可能与肾上腺肿瘤微血管形成、肿瘤增殖有关，有可能成为诊断标志物以及治疗的靶点。

肾上腺肿瘤；肾上腺增生；蛋白激酶Cα；血管内皮生长因子

目前肾上腺增生及肾上腺肿瘤的发病机制及两者之间是否存在因果关系还不完全明确。蛋白激酶Cα（protein kinase C α，PKCα）在细胞的增殖、分化、凋亡过程中起着重要的信号转导作用，因而对肿瘤的发生、发展具有重要意义［1～5］。另外，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以参与病理性血管生成，因而成为当今抗肿瘤研究的热点之一［6～8］，有研究提示VEGF在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达高于正常肾上腺组织［9～11］。本研究通过实时定量聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）、Western blot和免疫组化方法检测PKCα和VEGF在肾上腺腺瘤、肾上腺增生组织及正常肾上腺组织中的表达差异，分析其与肾上腺增生性疾病的关系，为进一步探索新的治疗方法提供试验材料及理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2011年6月至2013年6月间中国医科大学附属第一医院泌尿外科手术治疗切除的肾上腺标本73例，包括肾上腺腺瘤41例，良性肾上腺增生25例。肾上腺肿瘤组织及增生组织在术前均行生化及影像学检查辅助诊断，且经术后经病理证实。患者年龄23～68岁，平均48岁，其中男30例，女36例。另外，将7例肾癌根治术切除且经病理检查未见异常的肾上腺组织作为正常对照组。标本取材经我院伦理委员会批准并获取每位患者的知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

PKCα和VEGF引物，购自生工生物公司；β-actin，购自美国GenScript公司；TRIZOL、RNA LA PCR试剂盒及SYBR Primescript RT-PCR试剂盒，购自大连宝生物公司；鼠抗人PKCα多克隆抗体、鼠抗人VEGF多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体、GAPDH，购自美国Santa Cruz公司；DAB显色试剂盒，购自中衫金桥公司；K15C型低温超速离心机，购自美国Sigma公司；VC50T型超声粉碎仪，购自美国Sonics&Materials公司；MultiphorⅡ型电泳仪，购自瑞典Pharmacia Biotech公司；Trans-Blot SD型半干转膜，购自美国Bio-rad公司；Roche LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪，购自瑞士罗氏公司；OLYMPUS BH-2型双目显微镜，购自日本OLYMPUS公司。

1.3 实时定量PCR

用TRIZOL一步提取法提取总RNA，使用RNA LA PCR试剂盒使用说明进行逆转录。以β-actin作为内参照。引物序列：PKCα上游为5′-TGCTGACT TTGGGATGTG-3′，下游为5′-TGTTTGTTCTCGCTG GTG-3′；VEGF上游为5′-ATGAACTTTCTGCTGTC TTGG-3′，下游为5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′；β-actin上游为5′-TGACTTAGTTGCGTTACACC C-3′，下游为5′-CGAAGGCTCATCATTCAAAA-3′。逆转录反应条件：50℃30 min，99℃5 min，5℃5 min一个循环。PCR反应条件：94℃预变性2 min，之后以94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行45个循环，最后72℃延伸10 min。用βactin的浓度对扩增结果进行校正，用2-△△Ct法计算目的基因mRNA表达量。

1.4 Western blot

每例标本取50 mg，在4℃下加入400 μL裂解缓冲液，剪碎、匀浆，4℃12 000 r/min条件下离心45 min，留取上清进行蛋白定量，调定至等蛋白浓度后变性备用。取20 μL样品（含60 μg蛋白）行SDSPAGE电泳（5%浓缩胶，8%分离胶），电转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，0.1%TTBS清洗，一抗室温孵育过夜，TTBS洗膜，二抗室温孵育1 h，TTBS清洗，之后显色，Chemi Imager 5500电泳凝胶成像系统成像，检测样品中GAPDH表达作为内参照。

1.5 免疫组化

将切片常规脱蜡、水化后高温高压抗原修复，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知的PKCα和VEGF表达阳性的肝癌组织做阳性对照，以胞质呈棕黄色颗粒沉着为染色阳性。根据染色强度及染色阳性细胞数量进行强度分级。染色强度：基本不染色0分，染色淡黄1分，染色适中2分，深染3分。染色阳性细胞数：＜10%为0分，10%～≤25%为1分，＞25%～≤50%为2分，＞50%为3分。将每张切片的2项评分相加，0～1分为低表达，≥2分为高表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 实时定量PCR检测结果

PKCα、VEGF在肾上腺腺瘤、肾上腺增生组织和正常肾上腺组织中的表达趋势基本一致，PKCα mRNA在上述3类组织标本中的相对表达量分别为0.84±0.267、0.24±0.044、0.21±0.037，VEGF mRNA的相对表达量分别为1.00±0.288、0.25±0.042、0.19± 0.055。PKCα和VEGF在肾上腺腺瘤组中的表达明显高于肾上腺增生组（P＜0.05）和正常肾上腺组（P＜0.05）。虽然PKCα和VEGF在肾上腺增生组中的表达高于正常肾上腺组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 Western blot检测结果

如图1所示，PKCα在肾上腺腺瘤组中的表达明显高于肾上腺增生组和正常肾上腺组。VEGF在肾上腺腺瘤组中的表达也明显高于肾上腺增生组和正常肾上腺组。

图1 Western blot检测PKCα和VEGF的表达Fig.1 Expression of PKCα and VEGF of the specimens detected by Western blot

2.3 免疫组化检测结果

免疫组化染色结果（图2）提示PKCα和VEGF主要在肾上腺腺瘤的胞质中表达，部分血管内皮也可见表达。在肾上腺腺瘤组、肾上腺增生组中PKCα的阳性表达率分别为63.14%（26/41）、20.00%（5/ 25），VEGF的阳性表达率分别为68.29%（28/41）、16.00%（4/25）。PKCα和VEGF在正常肾上腺组织中的表达基本均为阴性。PKCα和VEGF在肾上腺腺瘤组中的表达均明显高于肾上腺增生组（P＜0.05）和正常肾上腺组（P＜0.05）；两者在肾上腺增生组和正常肾上腺组的表达无统计学差异（P＞0.05）。

图2 免疫组化检测PKCα和VEGF的表达情况×200Fig.2 Expression of PKCα and VEGF of the specimens by immunohistochemistry SP method×200

2.4 肾上腺腺瘤中PKCα与VEGF的表达水平与关系

根据肾上腺腺瘤中细胞着色程度和百分比，分为PKCα阳性表达组（26例）和PKCα阴性表达组（15例）。PKCα阳性表达组中VEGF的阳性表达率（84.62%）明显高于PKCα阴性表达组（40.00%），差异有统计学意义（P＜0.05），提示PKCα表达水平与VEGF可能有相关性。见表1。

表1 肾上腺腺瘤组织PKCα表达与VEGF表达的关系Tab.1 Relationship between the expression of PKC α and VEGF in adrenal adenoma tissue

2.5 PKCα和VEGF的表达与临床病理特征之间的关系

经统计学分析发现，肾上腺腺瘤组织中PKCα、VEGF在不同年龄组间和不同性别间阳性表达率无统计学差异（P＞0.05），但多发的肿瘤组织中PKCα和VEGF阳性表达率均高于单发的肿瘤组织（P＜0.05），直径≥4 cm的肿瘤组织中PKCα和VEGF阳性表达率均高于直径＜4 cm的肿瘤组织（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

肾上腺肿瘤是泌尿外科的常见外科肿瘤，其发生、发展的遗传学和组织病理学特点目前仍不清楚。临床实践中发现，肾上腺最常见的肿瘤是肾上腺腺瘤［12］。

PKC作为机体信号传导通路中重要因子之一，参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增殖、分化及癌变等一系列过程，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着重要的作用。有研究发现，PKC在肾癌［13］、胃癌［14］及乳腺癌［15］等多种组织中表达明显高于正常组织。本研究发现PKCα在肾上腺腺瘤中比在肾上腺增生组织及正常肾上腺组织中表达量高，提示肾上腺肿瘤在发生发展过程中可能会通过某种途径激活相关信号转导系统使得其表达量增多。

表2 PKCα、VEGF表达水平与肾上腺腺瘤临床病理特征之间的关系Tab.2 Relationship between the expression of PKCα and VEGF with the histopathology of adrenal adenoma tissue

VEGF在肿瘤血管形成及调节新生血管重塑、成熟等方面有着重要的作用，在乳腺癌［16］、胃癌［17］、肺癌［18］等肿瘤组织中新生血管的形成位点，VEGF的表达增多。曾有研究表明，VEGF在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达比在正常肾上腺组织中高，并且在恶性嗜铬细胞瘤中的表达高于良性嗜铬细胞瘤，提示VEGF有可能与嗜铬细胞瘤由良性向恶性转化有关。本研究中VEGF在肾上腺腺瘤中的表达比在正常肾上腺组织及肾上腺增生组织中的表达要多，提示VEGF可能参与肾上腺腺瘤发生过程中的血管通路建立，促进肿瘤生长。

本研究提示，在PKCα表达阳性的肾上腺腺瘤中VEGF表达也多为阳性，在PKCα表达阴性的肾上腺腺瘤中VEGF表达也多为阴性，两者呈相似的表达趋势，提示两者在肾上腺腺瘤的发生发展过程中可能存在一定程度的协同作用或关联。

本研究还发现PKCα和VEGF的阳性表达率与性别和年龄无明显相关，但是与肿瘤大小、肿瘤数量相关，提示PKCα和VEGF有可能和肾上腺肿瘤组织的增生活性、生物学特征有关，但需要进一步研究。本研究因肾上腺恶性肿瘤标本相对缺乏，因而对肾上腺肿瘤的发展、恶性化难以有系统完善的阐述，因此需要继续扩大样本量并跟踪研究才能进一步明确。

综上所述，PKCα和VEGF在肾上腺腺瘤组织中的表达高于肾上腺增生组织及正常肾上腺组织且有显著差异，提示PKCα和VEGF可能共同参与了肾上腺腺瘤的发生、发展，并有可能成为诊断标志物以及治疗的靶点。PKCα和VEGF在肾上腺增生组织中的表达均高于正常肾上腺组织但无统计学差异。鉴于正常肾上腺组织标本例数偏少，仍需要进一步探索研究。

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（编辑 陈 姜）

Expression ofProtein Kinase Cαand Vascular EndothelialGrowth Factor in Human AdrenalTumor

WANGYa-qi，KONGChui-ze，ZHANGZhe，BIXiao-jun，GAOXiao-lin

（DepartmentofUrology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

Objective To evaluate the expression ofprotein kinase Cα（PKCα）and vascularendothelialgrowth factor（VEGF）in adrenaltumor，adrenalhyperplasia and normaladrenaltissue，so as to supply a theoreticalbasis forthe diagnosis and treatmentofthese diseases.MethodsTotally 73 specimens of human adrenal gland were collected with clear pathological diagnosis，including 41 cases of adrenal adenoma，25 cases of adrenal hyperplasia，and 7 cases ofnormaladrenalsamples.The expression ofPKCαand VEGF ofthe specimens were determined by real-time PCR，Western blot and immunohistochemistry method.ResultsThe positive expression rates of PKCα and VEGF in adrenal adenoma were both significantly higher than adrenal hyperplasia and normal adrenal.The positive expression rates of PKCα and VEGF in adrenal hyperplasia were slightly higher than normal adrenal tissue；however，the difference between these two groups was not statistically significant.ConclusionThe high expression levels of PKCα and VEGF might be related with the angiogenesis and proliferation of adrenal tumor.PKCα and VEGF could be the new markers for the diagnosisand treatmentofadrenaltumor.

adrenal tumor；adrenal hyperplasia；protein kinase C α；vascular endothelial growth factor

R736.6

A

0258-4646（2015）09-0786-05

国家自然科学基金（81172438）

王亚奇（1985-），男，医师，硕士研究生.

孔垂泽，E-mail：kongchuize_cmu@sina.cn

2015-04-06

网络出版时间：