单纯疱疹病毒Ⅰ型的Th细胞和B细胞表位重组核酸疫苗的构建及真核表达

刘贤洁，孙原，马小力

（1.中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001；2.华北理工大学附属医院神经内科重症病房，河北 唐山 063000）

·论著·

单纯疱疹病毒Ⅰ型的Th细胞和B细胞表位重组核酸疫苗的构建及真核表达

刘贤洁1，孙原2，马小力1

（1.中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001；2.华北理工大学附属医院神经内科重症病房，河北 唐山 063000）

目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）糖蛋白B（gB）和糖蛋白D（gD）的Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗，并鉴定其真核表达。方法利用生物信息学分析软件预测HSV-1 gB和gD的Th细胞表位和B细胞表位，结合已发表文献，设计合成HSV-1的Th细胞和B细胞表位重组串联抗原基因（Th/B基因）。将Th/B基因定向克隆入真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX1-Th/B。用制备的质粒转染COS-7细胞，裂解细胞后经Western blot鉴定其蛋白表达。结果预测得到了HSV-1 gB和gD的Th细胞和B细胞表位，成功构建真核表达质粒pVAX1-Th/B，经测序确认序列正确。SDS-PAGE分离出相应大小的蛋白表达片段，经Western blot鉴定并证实该重组核酸疫苗能够在体外真核细胞中表达。结论成功构建HSV-1 Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗，并能够在体外真核细胞中表达，为HSV-1核酸疫苗的进一步研究打下基础。

单纯疱疹病毒；Th细胞和B细胞表位；核酸疫苗

单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virusⅠ，HSV-1）是一个嗜神经的双链DNA病毒，可以终身潜伏性感染神经元和胶质细胞。HSV-1感染宿主后引起角膜免疫病理反应并发生单纯疱疹病毒性角膜炎，感染的HSV-1长期潜伏在三叉神经节内，导致角膜反复感染而最终导致失明，是一种严重的致盲性眼病［1］。目前单纯疱疹病毒性角膜炎的治疗主要还是依赖抗病毒药物，但现有抗病毒药物不但具有一定的毒副作用，使耐药毒株增加，而且不能预防病毒感染和复发。因此，研制预防HSV-1感染及复发的疫苗具有重要意义［2，3］。本研究通过预测HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋白D（glycoprotein D，gD）的Th细胞表位和B细胞表位，构建HSV-1 Th细胞和B细胞表位重组串联抗原疫苗，为今后进一步研究HSV-1核酸疫苗打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种及细胞：pVAX1质粒和表达菌DH5α感受态细胞由本实验室保存。COS-7细胞为非洲绿猴的肾细胞，购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 分子生物学试剂：NheⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Polymerase Taq DNA聚合酶、质粒抽提试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。Histag抗体购于康为世纪公司，羊抗小鼠IgG-HRP购于碧云天公司，Attractene转染试剂购于QIAGEN公司，其余试剂均为国产或进口分析纯以上产品。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 Th细胞、B细胞表位重组串联抗原疫苗的设计：根据GenBank上公布的HSV-1（17株）的基因序列，获得gB和gD的氨基酸序列。利用生物信息学分析软件预测HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th细胞和B细胞表位。生物信息学主要组织相容性复合体Ⅰ类分子预测采用BIMAS（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）和 IEDB（http：// www.iedb.org）。生物信息学B细胞表位预测采用网络服务器Bcepred（http：//www.imtech.res.in/raghava/ bcepred/bcepred_submission.html）和IEDB。结合已发表的文献，优化选择抗原表位的编码基因，综合各项结果确定HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th细胞和B细胞表位。按照表位在基因组上的顺序，在各表位间添加适合的Linker设计Th细胞和B细胞表位盒，并通过蛋白二级结构预测网络服务器SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auomat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html）和蛋白酶体切割预测网络服务器PAPROC（http：//www.Paproc.de）优化表位盒的构成和Linker的选择。在此基础上在表位盒中加入内质网信号引导序列（Igκ链信号序列）和泛DR辅助T细胞表位（pan-DR helper T cell epitope，PADRE），以辅助表位更好地突破主要组织相容性复合体限制性而发挥功能，加入蛋白酶有限识别基序（GPGPG）作为间隔序列，起始端引入Kozak序列［4］介导mRNA翻译起始，末端加入His标签，两端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位点。根据设计的表位盒，复原其核苷酸序列，并参照真核优势密码子规则进行优化，设计Th/B基因。

1.2.2 真核表达质粒pVAX1-Th/B的构建：Th/B基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。Th/B基因定向克隆入真核载体pVAX1构建真核表达质粒pVAX1-Th/B，将质粒pVAX1-Th/B转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，NheⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定并交付金唯智公司DNA测序。

1.2.3 细胞转染：取对数生长期的COS-7细胞接种于6孔板中，每孔细胞悬液2 mL，每孔接种细胞5× 105个。于37℃、5%CO2的培养箱内平衡30 min后，加入转染试剂Attractene转染试剂和去内毒素提取的pVAX1-Th/B质粒，另设空载体转染对照组，每组均设2个复孔，用无血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养，24 h后收集细胞。

1.2.4 Western blot鉴定蛋白表达：将收集到的细胞加入细胞裂解液，静置5 min，用低温冷冻离心机离心10 min（12 000 r/min，4℃），分离上清为所得到的蛋白质抽提物。用5×Loading Buffer和PBS稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上样液，进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为13%，本次实验的上样体积20 μL，含40 μg蛋白，加入蛋白Marker体积为5 μL）。取适当大小的PVDF膜用“三明治”法进行转膜，转膜结束后取出PVDF膜进行封闭。以稀释比例1∶1 500的His-tag抗体为一抗工作液，倒入杂交袋中，放入封闭好的PVDF膜，压膜机封口后置于4℃冰箱过夜孵育一抗。将孵育一抗后的PVDF膜从杂交袋中取出，洗膜。以稀释比例1∶1 500的羊抗小鼠IgG-HRP为二抗工作液，倒入杂交袋中，放入漂洗好的PVDF膜，压膜机封口后置于37℃温箱45 min孵育二抗。将孵育二抗后的PVDF膜从杂交袋中取出，以ECL底物发光法在暗室进行曝光。

2 结果

2.1 HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th细胞表位和B细胞表位

利用生物信息学分析软件预测HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th细胞和B细胞表位，结合已发表文献，筛选出10个抗原表位，各抗原表位来源及氨基酸序列见表1。进一步优化表位设计，确定Th/B基因序列，设计的重组多表位串联基因长873 bp，编码280个氨基酸残基。

2.2 Western blot鉴定Th/B基因的蛋白表达

将经过SDS-PAGE电泳分离的蛋白条带经Western blot鉴定（图1），结果显示Th/B组出现了Histag的阳性识别条带，大小约30 kDa。而对照组则未见该区域条带，无目的蛋白的表达。

3 讨论

HSV-1的结构复杂，由双链DNA和病毒染色质磷蛋白组成核，20面体核壳包绕其上，核壳又被糖蛋白、碳水化合物及脂质所构成的包膜所包绕。HSV-1的包膜糖蛋白是细胞免疫和体液免疫的主要靶标，也是目前HSV疫苗的研究热点。目前已知HSV-1至少有12种糖蛋白［5］，其中gB和gD是病毒复制、穿入、细胞间扩散以及病毒囊膜与感染的细胞膜相融合所必需糖蛋白。gD是抗HSV感染中重要的保护性抗原，能保护动物免受HSV的攻击，抑制潜伏感染的发生，甚至在潜伏感染已建立后，也能减轻其复发［6］。gB在疱疹病毒家族中是高度保守蛋白，是病毒复制必需蛋白，也是宿主免疫反应的主要靶抗原，能诱导体液免疫、细胞免疫和细胞毒性T淋巴细胞反应［7］。目前，以HSV gD和gB为靶标的疫苗研究是HSV疫苗研究的热点［8］，已有研究证实gB和gD疫苗在预防角膜炎发生以及减少角膜新生血管形成上具有显著疗效。虽然gB疫苗或gD疫苗的单一使用均可产生一定的免疫保护作用，但不能完全避免单疱病毒性角膜炎的发生，也不能清除病毒的潜伏感染，单一接种gB或gD疫苗后部分小鼠体内仍可检测到病毒复制，说明任何单一的糖蛋白疫苗免疫作用均不完善［9］，单疱病毒糖蛋白联合疫苗或多表位疫苗可能是预防和治疗HSV较为理想的疫苗。

表1 重组多表位串联基因Th/B基因的抗原表位来源和序列Tab.1 Position and sequence of recombinant multi-epitope gene（Th/B gene）

图1 重组Th/B基因的蛋白表达Fig.1 Protein expression of recombinant Th/B gene

核酸疫苗被称为最有前景的第三代疫苗，作为一种新型的免疫手段，已经在感染性疾病和肿瘤的防治中展现了巨大的潜力，日益受到关注与重视。与传统的蛋白为基础的疫苗相比，核酸疫苗不仅可激发机体的体液免疫还可激发细胞免疫，便于修饰加工、进行免疫调节，特别是可以把不同抗原的多个优势抗原表位组合制备多表位疫苗，能够对机体形成多特异性、多层次的免疫保护，远远大于单抗原的保护能力。目前新发展的基于计算机生物信息学的抗原表位预测方法，使新表位的发现效率提高10～20倍，实验工作量减少95%，节约研究成本和时间，很大程度上加快了新表位的发现效率［10］，为我们研究HSV-1疫苗提供了新的思路。

因此，本研究选择HSV-1 gB和gD作为标靶抗原，应用生物信息学技术，采用计算机表位预测方法，预测HSV-1 gB和gD的Th细胞表位和B细胞表位。为使基因有效表达，在核酸5’端中加入Kozak序列（AATMG），它是真核生物mRNA 5’端帽子结构后的一段核酸序列，是提高基因表达的一个上游调控元件，可与翻译起始因子结合，介导翻译起始，增强外源基因在细胞内的表达。添加了内质网引导信号以促进表位信号更高效率的合成和折叠。另外，在设计中还加入了PADRE，由13个氨基酸残基组成（AKFVAAWTLKAAA），可以与人类的多数HLA-DR分子及部分小鼠的Ⅱ类基因分子结合。PADRE不仅能增加Th细胞的反应效能，比自然源性Th细胞表位高1 000倍，能增强核酸疫苗激发细胞免疫的能力；也可为B细胞表位及碳水化合物抗原提供辅助作用，同时诱导体液免疫及细胞免疫，对人体安全、无毒副作用。表位间采用了“GPGPG linker”，以减少表位间的干扰使之独立发挥功能。本研究对HSV-1 Th细胞、B细胞表位重组核酸疫苗进行了多步优化设计，并已证实可在真核细胞中表达，为今后的HSV-1疫苗研制打下基础。目前关于该疫苗的免疫原性和免疫保护性还有待进一步研究。

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（编辑 陈 姜）

Construction and Eukaryotic Expression of HSV-1 Th and BLymphocytes Recombinant Multi-epitope DNAVaccine

LIUXian-jie1，SUN Yuan2，MAXiao-li1

（1.Department of Ophthalmology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurology，Affiliated Hospital of North China University ofScience and Technology，Tangshan 063000，China）

Objective To construct the recombinant multi-epitope DNA vaccine of HSV-1 Th and B lymphocytes of gB-gD protein，and to identify its eukaryotic expression.MethodsThe epitopes ofHSV-1 gB-gDprotein were analyzed by bioinformatics analysis software.HSV-1 Th and Blymphocyte recombinantmulti-epitope gene（Th/B gene）was designed and synthesized.Th/B gene was cloned into pVAX1 to synthesize pVAX1-Th/B. pVAX1-Th/B was then transfected into COS-7 cell，and the protein expression was identified by Western blot.ResultsThe epitopes of Th and B lymphocytes of HSV-1 gB and gD were predicted，and the eukaryotic expression plasmid pf pVAX1-Th/B was successfully constructed and confirmed by sequencing.In addition，the in vivo protein expression of the recombinant DNA was confirmed by Western blot.ConclusionHSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNA vaccine was successfully synthesized in this study.HSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNAvaccine can be successfully expressed in isolated eukaryotic cells.This study provides a feasible solution fordeveloping DNAvaccine againstHSV-1 infection.

herpes simplex virus；Th cell and B cell epitope；DNA vaccine

R772.2

A

0258-4646（2015）09-0796-04

国家自然科学基金（81200656）；辽宁省博士启动基金（20111097）

刘贤洁（1986-），女，医师，硕士研究生.

马小力，E-mail：xiaolimax@gmail.com

2015-04-20

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