寄生性蠕虫丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

盖文燕，王君玮，付宝权

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

寄生性蠕虫丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

盖文燕1，2，王君玮2，付宝权1

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一种蛋白水解酶，广泛存在于生物体中。本文论述了丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类、结构、功能及在寄生性蠕虫中的研究进展。指出通过对Serpin的研究，有望使其作为寄生性蠕虫病诊断和疫苗的候选分子，为寄生性蠕虫病防治奠定基础。

寄生性蠕虫；丝氨酸蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂，也称蛋白酶抑制物。到目前为止，自然界中已经发现四类蛋白酶抑制剂，分别是丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor，简称Serpin）是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一类蛋白酶，它广泛存在于多细胞动物和植物界中。在植物、动物、病毒和微生物中已经发现了几百种Serpin，所有的Serpin都一个共同的保守结构—螺旋状反应位点（RSL），目标蛋白酶通过裂解RSL内部P1和P1′残基的肽键，使RSL被裂解[1]。Serpin参与到许多基本的生理学反应中，如血液凝固、（血）纤维蛋白溶解作用、炎症、信号级联放大、免疫应答、肿瘤抑制和荷尔蒙的传导[2]。寄生性蠕虫的Serpin通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使寄生性蠕虫免受宿主体内蛋白水解酶类的降解作用，从而逃避宿主的防御机制，有利于寄生性蠕虫在宿主体内存活。近年来寄生性蠕虫Serpin研究广泛的受到重视，本文就Serpin的分类、作用机制以及寄生性蠕虫Serpin的研究进展进行简要综述。

1 分类

Serpin超家族由40多个来源不同的成员组成，其中大多数的成员都是单链的糖蛋白，相对分子量

（Mr）为40 kDa～100 kDa，在羧基末端有一个反应位点[3]。根据Serpin与蛋白水解酶作用方式的不同，可将Serpin分为可逆的抑制剂和不可逆的抑制剂，MEROPS抑制剂家族是不可逆的抑制剂，Kunitz抑制剂家族和Kaza抑制剂家族是可逆的抑制剂；根据丝氨酸蛋白酶抑制剂存在部位的不同，可将Serpin分为细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂和细胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂两种。

2 作用机制

Serpin超家族是一个保守结构的蛋白质家族，有序列相似性。所有Serpin家族的成员都有一个由9个α螺旋和3个β折叠片组成的三级结构[4]。Serpin序列可分为基序、螺旋状反应位点（RSL）和信号序列三部分。RSL暴露在Serpin表面，位于Serpin序列的C末端附近，是Serpin的一个保守的功能性区。RSL有一个易裂开的结合物，这个结合物可以作为诱饵去捕获目标蛋白水解酶，当结合物捕获到目标蛋白水解酶后，Serpin通过诱导作用使蛋白水解酶的构象发生变化，从而使捕获到的目标蛋白水解酶的活性受到抑制[5]。当蛋白水解酶从RSL中裂解下来的时候，整个活性中心和蛋白水解酶一起经由丝氨酸活性位点穿过Serpin分子，在整个过程中蛋白水解酶构象发生了变化，并且是非常容易降解的。螺旋状反应位点（RSL）自身的氨基酸序列都具有高度的变异性[6]，RSL的高度变异性是Serpin一个显著地特征，这种氨基酸的差异性为抑制因子从根本上选择蛋白水解酶的特异性提供了可能[7]。

在寄生性蠕虫感染宿主的过程中，宿主体内的分泌的蛋白水解酶类增多，分解的蛋白水解酶类集中降解侵入宿主体内的寄生性蠕虫，而寄生性蠕虫的Serpin通过抑制宿主丝氨酸蛋白水解酶的活性，使寄生性蠕虫免受宿主蛋白水解酶的降解作用，从而逃避宿主的防御机制，有利于寄生性蠕虫在宿主体内存活。因此Serpin在宿主和寄生性蠕虫之间的相互作用中起着重要的作用。

3 研究进展

3.1 线虫

线虫有两种丝氨酸蛋白酶抑制剂：一类是经典的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin），Mr为40 kDa～100 kDa；另一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，以小的丝氨酸蛋白酶抑制因子（Smapin）来命名，Mr只有6.4 kDa。

马来丝虫（Brugia malayi）Serpin在线虫中是最早被发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。Yenbutr等[8]首次克隆到马来丝虫的Serpin基因BmY8，其融合蛋白Bmserpin的Mr为44.0 kDa。氨基酸序列与其它物种的Serpin有22%～30%的同源性，高度保守的氨基酸位点序列的相似性为35%～39%，这种特殊位点氨基酸的高度保守性可能是Serpin三级结构和功能所必须的[9-10]。大部分的Serpin活性位点都在高度保守的丙氨酸下游10个氨基酸处，而Bmserpin的高度保守的丙氨酸在349位点处。Bmserpin在马来丝虫感染阶段幼虫的表达量是成虫和微丝蚴表达量的10～16倍。马来丝虫的幼虫通过抑制XII因子和丝氨酸蛋白酶的功能，来抑制内源性凝血，从而抑制早期血栓的形成，这种抑制活性在马来丝虫粗提物和微丝蚴（Mf）中也存在。Bmserpin可以抑制人嗜中性粒细胞中的丝氨酸蛋白酶，有利于马来丝虫逃避宿主的免疫防御功能。Zang等[7]从马来丝虫cDNA文库中筛选到了马来丝虫的Serpin基因Bm-spn-2，Mr为47.5 kDa。Bm-spn-2只在微丝蚴（Mf）表达，它的第22位氨基酸的羧基端含有保守的Serpin信号序列。Bm-spn-2是目前已知的93种丝氨酸蛋白酶抑制中分子量最大的一种Serpin。

与马来丝虫一样，旋毛虫的Serpin有期特异性表达的特性，Nagano等[11]用旋毛虫感染两月后的小鼠血清免疫筛选旋毛虫肌幼虫cDNA文库，获得Serpin的阳性克隆Ts11-1，其融合蛋白的Mr为42.4 kDa。其氨基酸序列与马来丝虫Serpin的相似性约为30%，活性区域相似性约为50%。抗重组Ts11-1抗体可以识别新生幼虫和感染18天后的肌幼虫粗提物，分别获得Mr为42 kDa和37 kDa的蛋白条带，识别成虫（Ad6）有微弱的反应，但是不能识别感染30天后的肌幼虫。在新生幼虫和

感染18天后的肌幼虫，Ts11-1的转录水平较强，在成虫和感染30天后的肌幼虫转录水平较弱，可以推断旋毛虫Serpin只在肌幼虫的早期被合成。Ts11-1融合蛋白可以对胰蛋白酶活性进行剂量依赖性抑制，抑制效果比SigmaT9253还要好。吴秀萍等[12]也克隆到了旋毛虫Serpin基因片段，其融合蛋白与旋毛虫感染60天的猪血清反应，与感染26天的猪血清几乎不反应。Serpin在新生幼虫、感染后35天的肌幼虫、1-6日龄的成虫都有转录。并且在旋毛虫感染宿主35天（肌幼虫期）Serpin蛋白大量表达。

回旋钩尾丝虫（Onchocerca volvulus）的Serpin也是期特异性表达，Ford等[13]从回旋钩尾丝虫三期幼虫的cDNA表达文库中筛选出Serpin基因Ov-SPI-1。Ov-SPI-1与Ov-SPI-2一起构成了线虫新的Serpin家族Ov-SPI。Ov-SPI与猪蛔虫新型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Smapin）有相似性功能，它们都能保护寄生虫免受宿主肠道内蛋白水解酶的侵蚀。其融合蛋白具有Serpin超家族的特性，能抑制丝氨酸蛋白酶、特殊的弹性蛋白、糜蛋白和组织蛋白G的活性。Ov-SPI-1具有期特异性的表达，主要集中在三期幼虫角质层的基底层；成虫的Ov-SPI蛋白集中在精子和卵壳的周围，这有助于胚胎的发育。Ov-SPI在回旋钩尾丝虫的蜕皮、胚胎的发育和生殖发育过程及在终末宿主体内的定居均发挥着重要的作用。

锡兰钩虫中（Ancylostoma ceylanicum）存在着一种Kunitz型的Serpin，它与疾病的致病机理有关。Milstone等[14]从锡兰钩虫成虫中获得Serpin基因AceKI-1。其有线虫特有的前导序列，Mr为7.9 kDa，pI为6.79。融合蛋白rAceKI-1是一种紧密结合的抑制剂，可以抑制糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶和胰蛋白酶的活性。在锡兰钩虫成虫的可溶性蛋白和排泄分泌物可以检测到rAceKI-1抑制活性存在，但是在感染第3阶段的幼虫检测不到抑制活性。天然的AceKI蛋白分布于成虫的角质层中，AceKI-1能有效的抑制哺乳动物肠内蛋白水解酶，因此AceKI-1在寄生虫入侵和钩虫性贫血的发病机理中均发挥着重要的作用。同时融合蛋白rAceKI能部分的消除由锡兰钩虫引起的营养不良和生长延迟，说明rAceKI在疾病的致病机理中发挥的作用。

透明毛圆线虫（Trichostronglus vitrinus）感染阶段的粗提物中克隆到了丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Serpin[15]，它主要存在于第四阶段的幼虫和成虫的ES产物中。其融合蛋白能很好的抑制宿主体内的丝氨酸蛋白酶的活性，也能抑制宿主体内肥大细胞中蛋白酶的活性。Serpin可以调节感染阶段丝氨酸蛋白酶的活性；也可以通过抑制宿主炎症细胞释放的丝氨酸蛋白酶的活性而调节宿主的免疫反应。

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）的丝氨酸蛋白酶抑制剂hc-serpin，融合蛋白rHc-Serpin的Mr为40.3 kDa，PI为8.5[16]。在稳定的PH和温度的条件下，rHc-Serpin可以有效的抑制胰蛋白酶和抗凝血酶的活性。rHc-Serpin可以被自然感染的山羊血清特异性的识别。hc-serpin主要存在于捻转血矛线虫在成虫胃肠道的上皮细胞。

线虫中还有一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，它少于100个氨基酸残基，Mr为6.4 kDa。这种丝氨酸蛋白酶抑制剂与Serpin家族没有结构的相似性，以小丝氨酸蛋白酶抑制剂（Smapin）来命名。线虫还有一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，它少于100个氨基酸残基，Mr为6.4 kDa。在蛋白水平上，Smapin有10个半胱氨酸残基，它们相互作用形成的二硫键构成了蛋白质的核心，这种特殊的结构促进了Smapin与蛋白水解酶的相互作用。目前主要在猪鞭虫（Trichuris suis）中发现了Smapin的存在，Rhoads等[17]从猪鞭虫的成虫中分离到了糜蛋白酶抑制剂的基因TsTCI，它与蜜蜂幼虫血淋巴中的糜蛋白酶抑制剂（AmCI）有同源性。其融合蛋白Mr为6.6 kDa，主要抑制胰蛋白酶和靡蛋白酶的活性，不能抑制弹性蛋白酶﹑凝血酶和凝血因子Xa等的活性。TsTCI序列的N端活性区域与蜜蜂血淋巴蛋白酶抑制因子有36%的同源性，与该家族的其它成员没有序列的同源性，与猪蛔虫、单一异尖线虫、犬钩口线虫的Serpin和AmCI

在反应活性区域均有相似性。猪蛔虫聚集于酶丰富的消化道，而猪鞭虫主要集中在哺乳动物消化酶量少的盲肠和结肠，可能与TsTCI这种丝氨酸蛋白酶抑制剂有关。同时从猪鞭虫成虫中获得另外一种Smapin基因TsCEI[18]，其融合蛋白的Mr为6.4kDa，TsCEI与TsTCI有48%的序列相似性，与蜜蜂血淋巴蛋白酶抑制因子有36%的同源性，其与欧洲蟾蜍的胰蛋白酶抑制因子或凝血酶抑制因子﹑单一异尖线虫的弹性蛋白酶抑制剂、蛔虫的糜蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂均有序列的相似性。TsCEI主要通过调节肠粘膜的肥大细胞的蛋白水解酶和宿主的免疫反应，从而利于在宿主体内寄生。

3.2 吸虫

吸虫中也存在Serpin，Mr为40 kDa～100 kDa，但是目前其功能尚不清楚。Blanton等[19]通过免疫筛选从埃及血吸虫cDNA文库中筛选出丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin，融合蛋白的Mr为46.2 kDa，其天然抗原是一种糖蛋白，位于成虫的体表，Mr为54 kDa～58 kDa。序列对比发现其蛋白在活性区域有苯丙氨酸的存在，目前其功能还不清楚。Huang等[20]也从埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）中分离到Serpin，在Serpin的活性中心有抗胰蛋白酶的残基。与已知的Serpin超家族的成员不同，埃及血吸虫的Serpin是一种膜嵌合形蛋白，它存在于寄生虫的体表。

曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）有Serpin的存在，Ghendler等[21]从曼氏血吸虫成虫中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Smpi56，其融合蛋白的Mr为56.0 kDa。Smpi56能抑制抑肽酶和嗜中性粒细胞中的弹性蛋白酶的活性，不能抑制木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、糜蛋白酶、蛋白酶K、尿激酶和乙酰胆碱酯酶的活性。目前Smpi56的生物学功能尚不清楚，但是其弹性蛋白酶的抑制活性却被检测到，曼氏血吸虫可以利用Smpi56使自身免受嗜中性粒细胞的活化。

已报道从卫氏并殖吸虫（Paragonimus westermani）的cDNA文库中筛选到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PwSERPIN[22]，其融合蛋白rPwSERPIN的 Mr大约为43 kDa，PwSERPIN有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族基本的结构基序，与先前报道的其它寄生性蠕虫的Serpin序列相似性为16.5～29.6%。它能有效地抑制猪胰蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶和人凝血酶等酶的活性，对人的嗜中性的组织蛋白酶G、人的弹性酶和猪的弹性酶的抑制能力很低。它主要存在于寄生虫可溶性的提取物中，在排泄分泌物中（ESP）和不可溶性分泌物中不存在。PwSERPIN是胞内的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它在调节寄生虫胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性发挥着重要的作用。

最近从华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）后囊蚴时期的CDNA文库中筛选到一种新的丝氨酸蛋白酶抑制剂CsSERPIN[23]，与其它寄生性蠕虫的Serpin有很高的序列相似性。其开放读码框编码382个氨基酸，融合蛋白rCsproSERPIN的Mr为42.2 kDa。CsSERPIN的转录本在华支睾吸虫后囊蚴时期的表达量明显高于成虫时期。

3.3 绦虫

绦虫的Serpin为典型的细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前绦虫中只发现一种Serpin。多房棘球绦虫（Echinococcus multilocular）中分离到Serpin基因是扁形动物门中第一个发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族[24]，其氨基酸序列没有N末端的糖基化位点。Serpin融合蛋白有丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性，可以抑制哺乳动物肠道内胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶两种消化酶的活性。

4 展望

Serpin在寄生性蠕虫中广泛存在，在调节内源性蛋白酶和外源性蛋白酶中均发挥着重要的作用。目前在线虫、吸虫和绦虫中均有Serpin的存在，它们大多数都是非经典的Kazal抑制剂家族。在线虫中发现了一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Smapin），它的Mr只有6.4 kDa，经典的Serpin的Mr为40 kDa～100 kDa，两者的分子量存在很大的差异，但是在功能方面Smapin与Serpin的差异性却很小，因此还需要继续进行相关方面的研究。寄生性蠕虫Serpin通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使寄生性蠕虫免受宿主蛋白酶的降解作用，从

而逃避宿主的防御机制，有利于寄生性蠕虫在宿主体内存活。Serpin可以干扰宿主的保护机制，可以被免疫系统识别，从而引起宿主抗体应答。另外Serpin也控制内源性蛋白酶参与寄生虫的生殖和发育过程中。因此通过对Serpin研究，有望使其作为寄生性蠕虫病诊断和疫苗的候选分子，为寄生性蠕虫病防治奠定基础。

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Research Progress on Serine Proteinase Inhibitor（Serpin）in Parasitic Helminth

Gai Wenyan1，2，Wang Junwei2， Fu Baoquan1*
（State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology；Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture；Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province；Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，Gansu 730046；China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Serine proteinase inhibitor，also called Serpin belongs to a proteinase enzymes distributed ubiquitously in organisms. The construction，function of Serpins and the research progress on Serpins in parasitic helminthes were briefly reviewed in this article，pointing out that Serpin could be the candidate molecule in parasitic helminth diagnostics and vaccine.

parasitic helminth；serine proteinase inhibitor（Serpin）

R978.6

A

1005-944X（2015）03-0057-05

国家“十一五”科技支撑计划项目（2007BAD40B03）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（0032007012）；甘肃省科技重大专项（0702NKDA039）；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目

付宝权