消化法检验旋毛虫病最适条件的筛选

吴秀萍，王 迪，李庶东，孙召金，刘明远

（1.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫与病原生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫和丝虫病合作中心，上海 200025；2.吉林大学人兽共患病研究所，人兽共患病教育部重点实验室，吉林长春 130062；3.中国96423部队，陕西 721012）

消化法检验旋毛虫病最适条件的筛选

吴秀萍1，2，王 迪2，李庶东3，孙召金2，刘明远2

（1.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫与病原生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫和丝虫病合作中心，上海 200025；2.吉林大学人兽共患病研究所，人兽共患病教育部重点实验室，吉林长春 130062；3.中国96423部队，陕西 721012）

[目的] 筛选出“消化法”检测旋毛虫病的最适检测条件，即消化后收集虫体所需要的沉降温度和沉降时间，为改善现有屠宰动物旋毛虫病“消化法”检验技术提供重要的参考数据。[方法] 将12个旋毛虫国际标准虫株（8个种和4个基因型）感染Balb/c小鼠，感染40天后剖杀，分别在4℃和25℃条件下计算不同时间点的回收肌幼虫百分比，计算不同温度不同时间点收集到的肌幼虫数目与消化液原液总的肌幼虫数目的比值及沉降速率。[结果] 比较发现旋毛虫不同种及基因型在不同温度和沉降时间上回收的肌幼虫百分比存在明显差异，确定出适合已知旋毛虫每个种和基因型的消化法检验最适条件，筛选出最适条件为4℃沉淀、至少沉降45分钟。[结论] 现有消化法检验旋毛虫病的国际“金标准”确实存在一定的偏差和不足，在实际应用中有可能造成旋毛虫病的漏检。本研究结果筛选出适合消化法检验旋毛虫病的最适条件，为进一步完善消化法检测旋毛虫病的国际“金标准”提供参考。

旋毛虫病；消化法；最适条件；筛选

旋毛虫病是一种重要的食源性人兽共患寄生虫病，呈世界性分布，目前在一些发展中国家（如泰国、 阿根廷及中国等）仍常有暴发，不但危害人类公共卫生，而且成为影响猪肉生产和食品安全的重大经济问题之一。鉴于其暴发频率、感染人数及危害性，在欧盟2006年公布15种重要新发与再发性人兽共患病病种中，旋毛虫病作为唯一的食源性寄生虫病名列其中，已成为世界各国更是世界卫生组织（WHO）法规规定的屠宰动物强制性、首检和必检病种（我国始于1956年）[1-3]。

旋毛虫国际消化法采用统一标准和规定[4]，但实际上旋毛虫不同种与基因型存在不同的生物学特征[5，6]，因此理论上在消化和收集方法上应存在一定的差异。“消化法”是目前屠宰动物旋毛虫病检验的金标准方法，统一规定在室温（25℃左右）沉降30分钟。但某些种或基因型可能会因沉降温度不适、沉降时间不足导致无法全部回收消化后的所有幼虫，这不但可导致旋毛虫感染程度的误判，更为严重的是可能导致旋毛虫病的漏检（幼虫没有沉下来，误判为阴性）。

本研究以Balb/c小鼠为动物模型，利用实验室保存传代的旋毛虫12个国际标准株（8个种和4个基因型）感染Balb/c小鼠，按照旋毛虫国际标准集样消化法，分别在4℃和25℃条件下，计算不同时间点的肌幼虫的回收率及沉降速率，针对已知的旋毛虫8个种和4个基因型，通过系统比较和分析消化法检测条件上的差异，筛选出适合消化法检验旋毛虫的最佳条件，以期改善现有旋毛虫国际标准消化方法可能存在的弊端。因此，本研究项目的开展对进一步完善屠宰动物旋毛虫病检验“金标准”具有重要的现实意义和应用价值。

1 材料

1.1 实验动物

传代小鼠用昆明小鼠，购自白求恩医学院；计数小鼠购自白求恩医学院的6～8周龄的Balb/c小鼠。

1.2 旋毛虫虫株

旋毛虫12个国际标准株 ：本实验室保存传代，分别是：T1（ISS004）、T2（ISS042）、T3（ISS100）、T4（ISS013）、T5（ISS415）、T6（ISS034）、T7（ISS037）、T8（ISS124）、T9（ISS408）、T10（ISS572）、T11（ISS1029）、T12（暂未明确）

1.3 主要试剂和仪器

胃蛋白酶（1∶10000）和胃蛋白酶（1∶3000）购自 AMRESCO公司；浓盐酸、医用低温冰箱、电热恒温培养箱、高速自控组织捣碎机、恒温磁力搅拌器和显微镜。

2 方法

2.1 感染性实验

取实验室保种传代的昆明小鼠剖杀，通过消化法分别收集12个标准虫株的肌幼虫，按照300条/只的剂量接种Balb/c小鼠，每个旋毛虫虫株接种15只，接种后每天观察其状况。

2.2 沉降温度和沉降时间对各虫株肌幼虫回收率的影响

旋毛虫国际消化法：小鼠剥皮去内脏，用绞肉机绞碎，集样称取100g鼠肉消化。用烧杯装2L的46℃胃蛋白酶消化液，将绞碎的鼠肉倒进消化液里，在46℃温箱内搅拌消化30min，将消化液通过80目筛网过滤到2L的分液漏斗内，沉降半小时，用小烧杯收集40mL的沉降液在显微镜下观察计数。

本实验对感染40天的小鼠，每个虫株取15只，分成三组剖杀（即重复三次），先按照标准消化法进行消化并抽取消化原液计数，计算出每一个虫株所收集到的肌幼虫总数；重悬混匀虫体，进一步通过改变沉降温度和沉降时间，检测其肌幼虫回收率，具体方法如下：

2.2.1 抽取消化原液计数。首先在消化完全后，在消化液混匀的状态下，抽取10mL消化液，分装在24孔板上，每一毫升要分为4个孔。因为每个孔在低于250uL液体的时候才能看清楚。在显微镜下计数，得出每毫升消化液里的肌幼虫数目。然后用计算得到的每毫升肌幼虫数目×消化液体积=肌幼虫总数。

2.2.2 沉降温度和时间。沉降温度分为4℃和25℃；沉降时间分为20min、30min、45min、

60min、75min 5个时间点，每个时间点取40mL沉降液体，计数。

2.2.3 计算沉降速率和统计沉降最适条件。在各个温度的时间点上计算沉降肌幼虫占肌幼虫总数的百分比，确定旋毛虫不同种及基因型的最佳沉降温度时间条件。用分液漏斗装入2L消化液后的液体高度，除以沉降肌幼虫百分比达100%时的时间，得到沉降速率。

2.3 数据统计与分析

根据本实验数据，按照标准的旋毛虫国际消化法统计出在室温条件下沉降30min，旋毛虫不同种和基因型回收率情况；回收率达到99%以上所需要的沉降条件；不同种和基因型在不同沉降温度和沉降时间回收率到达99%以上的平均沉降速率；通过消化法收集肌幼虫回收率达到95%以上所需要的沉降条件。

3 结果

3.1 不同温度和沉降时间对肌幼虫回收率的影响

回收率是指在集样消化法中不同沉降时间收集到的肌幼虫数目与利用原消化液计算的总肌幼虫数目的百分比。旋毛虫8个种和4个基因型在4℃和25℃条件下，不同时间点即20min，30min，45min，60min，75min回收率明显不同，在25℃大多数回收率都低于99%，只有T11达到99%以上，本实验12个旋毛虫虫株的回收率情况如下：

（1）T1、T3、T4、T11的肌幼虫回收率受温度影响不大：T1在4℃或者25℃下沉降60分钟，回收率达99%以上；T3沉降时间从45分钟至75分钟，回收率基本维持在93%～94%之间；T4在4℃和 25℃沉降45-75分钟，回收率均维持在95-98%之间；T11在4℃和25℃沉降30分钟，回收率均可达99%以上；

（2）T2、T5、T6、T7、 T8、T9、T12均在4℃沉降回收为佳：T2沉降时间延长至75分钟回收率也仅为97.08%；T5延长沉降时间至75分钟，回收率达到99.41%；T6沉降时间在45分钟，回收率可达99%以上；T7在 4℃比25℃回收率偏高，在4℃沉降45分钟，回收率可达99.54%，在25℃延长至75分钟回收率为98.39%；T8沉降时间为30分钟，回收率可达99.57%；T9肌幼虫回收率在4℃比25℃偏高，在4℃沉降60分钟，回收率可达99.17%，而在25℃需要75分钟；T12沉降时间延伸到75分钟以上，回收率仍低于90%。

（3）T10肌幼虫回收率在25℃回收率稍有偏高，但沉降时间延长至75分钟回收率仍低于99%；

3.2 按照国际消化法室温沉降30min能收集到的T1-T12的肌幼虫数目百分比

根据本实验数据统计，按照标准的旋毛虫国际消化法，在室温条件下沉降30min，不同种回收率有明显差异，并且只有T11的回收率可达到99%以上，甚至T10和T12的回收率还达不到80%，详见表1。

表1 国际消化法回收到的肌幼虫百分比

3.3 本实验中T1-T12消化法收集肌幼虫回收率达到99%以上的沉降条件

根据本实验数据，统计出旋毛虫8个种和4个基因型通过消化法收集肌幼虫回收率达到99%以上所需要的沉降条件明显不同，仅有T8和T11在沉降时间为30分钟时回收率达到99%以上，其它都需要延长沉降时间且多在4℃沉降为佳，对于T2、T3、T4、T10和T12沉降时间延长至75分钟回收率也无法达到99%以上，详见表2。

3.4 T1-T12沉降速率

沉降速率：分液漏斗高度与T1-T12回收率达到99%以上所需时间的比值。在本实验中，进一步系统地计算出旋毛虫8个种和4个基因型在不同沉降温度和沉降时间回收率到达99%以上的平均

沉降速率（除了T2、T3、T4和T12），结果表明T11沉降最快，T5和 T10较慢，其他几个种和基因型沉降速率没有太大差异，详见表3。

表2 T1-T12肌幼虫回收率到达99%以上所需沉降条件

表3 T1-T12沉降速率表

3.5 T1-T12回收率达到95%以上时的温度和时间条件

在屠宰场检验时，要求时效性，以节省时间和以实际应用为目的，故统计出在沉降百分比达到95%以上的最适沉降温度和时间。结果表明：除了T3、T10和T12，其他种和基因型均在低于45min回收率可达到95%以上，其中T3和T11仅需要20min，沉降温度多在4℃为佳，详见表4。

4 讨论

旋毛虫的检测方法主要包括：镜检法、集样消化法和血清学检测[4]。镜检法和集样消化法属于直接检测法，目前旋毛虫检验“金标准”是集样消化法。对于常规屠宰猪尸体检验，用消化法消化至少1g最佳部位的肉来检查；为达到更高的诊断敏感性，对于马肉和野味肉，应选取至少5-10g的最佳部位肌肉分别进行消化；人工消化法允许检测100克尸体碎块。尽管人工消化法需要更多的技术设备，但它满足了成本效益和敏感性、效率的要求，没有包囊的旋毛虫在液态消化液里也可以被检测出来。通过消化液（含有1%胃蛋白酶和1%浓盐酸）使肌幼虫释放出来，经过滤和沉降过程，在显微镜下检测肌幼虫[4]，目前旋毛虫检验国际“金标准”的集样消化法采用统一的沉降条件，即消化后在室温（25℃左右）沉降30分钟，镜检肌幼虫。

表4 T1-T12肌幼虫回收率到达95%以上所需沉降条件

根据旋毛虫国际消化法的“金标准”，本研究结果表明已知12个旋毛虫虫种的肌幼虫回收率均未能达到100%，只有T8和T11的肌幼虫回收率可以达到99%以上且沉降速率较快，其他在75%～98%之间，且多数在4℃沉降为佳，因此本研究证实了旋毛虫国际消化法的金标准的确存在一定的偏差和不足，表明现有旋毛虫消化法的国际“金标准”在实际应用中有可能造成旋毛虫病的漏检。另外，在实验过程中发现沉降温度对T2的肌幼虫回收率影响很大，在低温环境下沉降速度较快，这可能与其地理分布有关，T2主要分布在低温地区，是最耐冷的旋毛虫虫种，在冰冻的肌肉中甚至能存活几年；而T10肌幼虫整体上沉降速度都很慢，这可能与其形态有关，T10是无包囊旋毛虫，在肌肉中呈伸展长条状，消化后肌幼虫剧烈运动及不卷曲形态影响了其沉降速度；T5多数成松散卷曲或曲线、运动缓慢、在液体中悬浮，这些形态特征极大地影响了其沉降速度；T12的肌幼虫体型最细小，多数都成漂浮状态，也许因其比重较低导致其沉降很慢、肌幼虫回收率很低，即使沉降时间延长到75分钟，也仅仅达到89%左右的回收率。因此，旋毛虫不同种及基因型的生物学特性的差异[5-9]，如地理分布、耐冷耐热、形态大小、运动形态、有无包囊、宿主及繁殖能力等可能与肌幼虫回收率的高低密切相关。

本研究成功筛选出适合消化法检验旋毛虫病的最适条件，为进一步完善现有旋毛虫病检验“金标准”（即“集样消化法”）的提供了重要实验参考数据，对规范旋毛虫病诊断方法具有重要意义。

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The Screening of Optimum Conditions of Digestion Method for Detecting Trichinellosis

Wu Xiuping1，2，Wang Di2，Li Shudong3，Sun Zhaojin2，Liu Mingyuan2
（1.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025；2.Institute of Zoonoses，Key Laboratory of Zoonoses，Ministry of Education，Jinlin University，Changchun，Jilin 130062；3.PLA Unit 96423，Shaanxi 721012）

[Objective] To screen the optimum conditions including sedimentation temperature and sedimentation coefficient in collecting larvae after digestion，providing important reference data to improve the current “digestion method” for detecting trichinellosis in slaughtering animals.[Methods] 12 international reference Trichinella strains including 8 species and 4 genotypes were used experimentally to infect Balb/c mice，which were killed 40 dpi. The ratio of recovered muscle larvae and total muscle larvae in the digesting fluid were calculated respectively at 4 ℃ and 25 ℃and at different time points，and then the sedimentation coefficient of different Trichinella species and genotypes were compared and analyzed. [Results] It was found through comparison that the muscle larvae recovery rates differed significantly in different Trichinella species and genotypes at different sedimentation temperature and time. The optimum conditions of digestion method for the known Trichinella species and genotypes were screened：the digested larvae should be settled at 4℃ for at least 45min. [Conclusion] This study demonstrated the current international gold method for detection of Trichinellosis by means of digestion had certain bias resulting in misdetection. The screening optimum conditions of digestion method for detecting different Trichinella species and genotypes in the study provided the reliable experimental data and reference value to improve international gold digestion method for detecting Trichinella.

Trichinellosis；Digestion Method；Optimum Conditions；Screening

R383.15

B

1005-944X（2015）03-0062-05

国家自然科学基金资助项目（NSFC31030064）

吴秀萍，刘明远