细菌污染对小鼠胚胎发育的影响

周文静，冯颖，王慧红，沈蓉蓉，徐维海

（浙江省杭州市妇产科医院生殖中心，杭州 310000）

体外胚胎培养的各个环节均有可能发生细菌污染，现在用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的培养液基本都含有抗生素，可以抑制多数细菌的生长，但耐药菌株的存在却仍然能够污染胚胎培养体系，从而影响到胚胎发育。细菌污染对胚胎发育的影响目前尚未见文献报道。本文观察了小鼠卵裂期胚胎受到污染后的发育情况，并对部分受污染胚胎更换含不同抗生素的培养液，观察补救措施对污染胚胎发育结局的影响，探讨胚胎细菌污染的处理思路。

一、材料与方法

1.大肠杆菌菌液制备：大肠杆菌由本院细菌室分离，为庆大霉素耐药［最低抑菌浓度（MIC 12）μg／ml］，阿米卡星敏感（MIC≤2μg／ml）菌株，采用比浊和倍比稀释配制100cfu／ml的菌悬液备用。

2.小鼠胚胎获取和分组：5 只7 周龄的雌性C57BL／6J小鼠腹腔注射孕马血清（PMSG）10U／只，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）10U／只，按雌雄比例1∶1合笼，24h后处死雌鼠取胚，剔除碎片较多和质量差的胚胎。获取90枚2-细胞胚胎，随机分成3组，每组30个胚胎：A 组为对照组，B组为细菌污染后未采取干预组，C 组为细菌污染1d后更换含不同抗生素的培养液组。

3.培养条件：含10%血清代用品SSS（Irvine，美国）的G-1培养液（Vitrolife，瑞典）制成50μl的微滴（G-1培养液成分中已含有庆大霉素），矿物油覆盖，所有胚胎置于微滴中37℃、6%CO2饱和湿度培养箱中培养。

4.实验方法：按组别在每个微滴加入10 个小鼠胚胎，每组3个微滴。在B组和C 组微滴中加入大肠杆菌悬液20μl，培养24h后（D1）观察各组胚胎发育和细菌生长情况，并将C 组胚胎清洗后转入新配制的添加了阿米卡星的G-1培养液中继续培养，72h后（D3）再次观察各组胚胎发育和细菌生长情况。

5.观察指标：各组的胚胎发育、胚胎死亡、囊胚形成和细菌生长情况。镜下观察，将卵裂球退化、崩解的胚胎判定为死亡。囊胚的分期和质量评价根据David Gardner囊胚评分标准［1］。对微滴中培养液进行细菌培养，判定细菌生长情况。

6.统计学分析：相关数据采用SPSS 13.0进行分析，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.D1观察结果：A 组培养液清亮，胚胎全部存活；B组和C组培养液浑浊，镜下观察有密集的类似杆菌形态物质存在；B 组和C 组的胚胎存活率均显著低于A 组（P 均＜0.001），B 组和C 组之间的胚胎存活率无显著性差异（P＞0.05）。B、C 两组的存活胚胎卵裂球数和细胞间致密程度明显低于A 组胚胎，呈现发育迟滞的现象（表1）。

2.D3观察结果：A 组培养液清亮，胚胎全部形成囊胚；B 组培养液浑浊，胚胎全部死亡；C 组培养液清亮，囊胚形成率显著高于B 组（P＜0.001），但明显低于A 组（P＜0.001）（表1）；A 组囊胚以IV期和V 期囊胚为主，囊胚腔均已较好的扩张，囊胚的内细胞和滋养细胞数量较多，优质囊胚较多（96.7%）（表2），C 组囊胚腔较小，部分为囊胚腔未完全扩张的II期囊胚，内细胞和滋养细胞数均较少，无优质囊胚（图1）。细菌培养结果提示A 组和C组培养液中均无细菌生长，B 组培养液中证实为大肠杆菌生长。

表1 三组胚胎发育情况［n（%）］

表2 A、C两组囊胚质量评价

图1 体外培养D3胚胎形态（×200）

三、讨论

细菌污染是体外胚胎培养中可能发生的严重事件，精液、卵泡液、培养液和环境中的细菌都有可能成为污染来源，实验室可以通过加强无菌操作的意识、使用含有抗生素的培养液等方法进行预防，但在IVF过程中胚胎污染仍然有一定的发生率，朱桂金等［1］曾报道胚胎污染的发生率为0.51%，最主要的污染来源是带菌的精液，其中大肠杆菌是引起胚胎污染的最常见的病原体之一［2-3］。

细菌污染可以对胚胎的生长和发育造成严重影响。细菌快速生长繁殖，消耗了培养液中的营养，释放大量对胚胎具有毒性的代谢物。大肠杆菌等革兰氏阴性杆菌在繁殖或死亡时还释放内毒素，对胚胎具有细胞毒作用［3-4］。本研究采用大肠杆菌污染小鼠2-细胞胚胎，结果显示，胚胎受到细菌污染第1天即出现死亡，存活胚胎的发育也受到了严重的影响，出现了较多的低质量胚胎，不作处理继续培养，胚胎则全部死亡。而对被污染胚胎进行换液处理，能显著改善污染胚胎发育的结局，因为更换培养液能去除大部分的细菌，而新加入的抗生素能有效地抑制细菌生长，因此存活胚胎得以继续发育。部分受到污染的胚胎换液虽然能够继续发育形成囊胚，但发育潜能仍然受到了损伤，这些囊胚的囊胚腔均较小，部分囊胚腔未完全扩张，内细胞团小，滋养细胞也较少，总体囊胚质量较差。这说明虽然细菌污染已经清除，但早期发生的细菌污染已经对胚胎造成了损伤，有数据表明，由卵裂期质量较差胚胎发育而来的囊胚，非整倍体概率增加，种植率和妊娠率均降低［5］。

人类胚胎培养中污染的胚胎处理仍是一个有争议的问题，我们通过对细菌污染的小鼠胚胎发育观察发现，对于早期（D1）发现的细菌污染，如果及时进行换液和更换抗生素体系的处理，可以完全去除耐药菌的污染，使部分有发育潜能的胚胎继续发育。但是在本研究中，污染换液组得到的囊胚质量并不高，这可能是由于污染菌以及其产生的各种毒素和代谢的酶类对胚胎细胞的超微结构和分子水平造成了远期的影响，冲洗和换液过程中也有可能对胚胎造成损伤，细菌污染对胚胎发育的远期影响仍需要进一步的观察和数据评估。对于卵巢功能较差的患者，能够得到可供移植的胚胎的数量是有限的，如果可以对污染的胚胎进行处理，对于去除污染并发育为囊胚的胚胎进行移植，可增加病人妊娠的机会。人类胚胎培养中也有发生污染后经过处理成功妊娠并分娩的报道［6-7］。但是出于对胚胎质量的担忧和母体感染风险的考虑，目前大多数中心并不建议移植污染胚胎，因此对于发生细菌污染的IVF周期，首先要确定病原体的种类和来源，针对不同的污染来源采取相应对策。对于来自患者精液或卵泡液中的病原体，下次周期前可使用敏感抗生素取卵或取精前预防用药，使用含有不同抗生素体系的培养液，如果证实细菌来源是精液的病例，可改行ICSI方式受精，避免精液中细菌接触到卵子和培养体系从而杜绝污染的可能性［8］。

［1］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［2］ 朱桂金，魏玉兰，胡娟，等.体外受精过程中胚胎污染及其来源的探讨［J］.中华妇产科杂志，2004，39：382-384.

［3］ Snyman E，VanderMerwe JV.Endotoxin-pollutedmedium in a human in vitro fertilization program［J］.Fertil Steril，1986，46：273-266.

［4］ Kastrop PM，de Graaf-Miltenburg LA，Gutknecht DR，et al.Microbial contamination of embryo cultures in anART laboratory：sources and management［J］.Hum Reprod，2007，22：2243-2248.

［5］ 鲁振宇，张云山，糜若然.胚胎发育对囊胚形成的影响［J］.天津医药，2010，38：257-259.

［6］ 罗清炳，杨梅，王华，等.体外受精过程中胚胎污染的临床结局分析（附精液反复污染改行ICSI妊娠一例）［J］.优生与优育杂志，2009，17：115-116.

［7］ 李俐琳，李穗萍，林雯青，等.人类胚胎体外培养细菌污染12例分析［J］.热带医学杂志，2012，12：1106-1107.

［8］ Seidman DS，Madjar I，Levron J，et al.Testicular sperm aspirationandintracytoplasmic sperm injection forpersistent infection of the ejaculate［J］.Fertil Steril，1999，71：564-566.