能量限制下SIRT1高表达对大鼠卵巢生殖寿命的影响

向延芳，傅玉才，许锦阶，栗丽，罗丽莉＊

（1.解放军第169医院妇产科，衡阳 421002；2.汕头大学医学院细胞衰老实验室，汕头 515041；3.汕头大学医学院第一附属医院妇科，汕头 515041）

始基卵泡自胚胎形成后即进入自主发育和闭锁的轨道，当功能性卵泡完全丧失后，卵巢衰老萎缩进入绝经期［1］。卵泡从卵巢中持续丢失，就好像时钟的指针在不断前进，所以国外有学者将这一现象称为“女性的生物钟”［2］。始基卵泡的储备量与生俱来，如果能延缓卵泡成熟的速度，减少卵泡的凋亡将可能延长女性的生育年限［3］。能量限制（CR）是一种目前公认的有效延缓衰老的方法，不仅能延缓衰老，还能延缓和预防一些与年龄相关疾病的发生发展［4－5］。本实验中对成年期大鼠限制其能量摄入，观察CR后长寿因子SIRT1在卵巢中的定位、表达，探讨其对大鼠卵巢功能和生殖寿命的影响及可能机制，为抗卵巢衰老研究提供新的实验依据。

材料与方法

一、实验动物及分组

由汕头大学医学院实验动物中心提供清洁级健康8周龄雌性Sprague－Dawley（SD）大鼠24只，初始体重（200±10）g。实验期间，动物房室温保持在22℃左右，保持12h自动照明。

动物适应性喂养2周后随机分为：对照组（NC），自由饮水，自由取食；CR组，予NC组食量的65%。标准鼠粮持续喂养8周，饲料（执行标准：GB14924.3－2001，含蛋白质20.11%、脂肪4.84%、粗纤维7.34%）总能量为17.3282MJ／kg。

二、仪器和试剂

仪器：BX－51TRF型生物显微镜（Olympus，日本），普通光学显微镜（云南光学仪器厂），动物饲养层流柜（广州医疗器械厂）。

试剂：苏木精（上海化学试剂采购供应站试剂厂），伊红（上海试剂三厂），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司），兔抗鼠SIRT1、β－actin多克隆抗体（Santa Cruz，美国），生物素连接的抗兔IgG抗体（Jackson，美国）；ABC（avidin－biotin complex）试剂盒（Vector Laboratories，美国）。

三、研究方法

1.卵巢组织形态学观察及卵泡分类计数：每个卵巢取7张组织切片，切片间隔至少为50μm进行H－E染色。计数每张卵巢组织切片上所有的各级卵泡数（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡和闭锁卵泡）。

2.免疫组织化学法（ABC法）检测SIRT1在卵巢组织中的定位和表达：组织切片脱蜡、水化后，3%H2O2作用10min，用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次时间为5min。2%的小牛血清白蛋白封闭30min后滴加兔抗鼠SIRT1抗体（一抗），4℃湿盒中孵育过夜；PBS缓冲液洗涤后滴加二抗，室温孵育1h；与ABC试剂反应30min；DAB显色后苏木素复染、1%盐酸酒精分化，脱水、透明、封片。PBS替代一抗作为空白对照。Olympus BX－51型显微镜（日本）下观察并拍照。阳性结果判断：细胞内棕色或棕黄色颗粒为阳性结果。应用SimplePCI软件进行分析计数，灰度值≤55为强阳性，反之为弱阳性。

3.Western blot检测SIRT1蛋白在卵巢中的表达：取新鲜的卵巢放入组织匀浆器中，冰上匀浆提取组织总蛋白，测蛋白浓度；各实验组均上样30μg蛋白，进行SDS－PAGE电泳，转膜；5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别加入稀释的β－actin或SIRT1抗体约1ml于室温下摇床孵育2h；弃一抗，洗涤后加二抗室温下摇床孵育1h，加入ABC反应试剂，ECL化学发光，暗室下X光片成像。GIS凝胶成像系统（上海 Tanon GIS－2009）分析其灰度值。

四、观察指标

能量摄入：每天称取饲料，计算摄取热量；大鼠体重：每周称取体重记录；腹部脂肪重量：实验结束时分离肾周组织和腹膜后脂肪称重；卵巢组织形态学及卵泡分类计数；STRT1蛋白在卵巢中的定位和表达。

五、统计学方法

结 果

一、两组大鼠每周平均体重比较

图1 两组大鼠体重变化情况

与对照组大鼠比较，CR组的大鼠表现为体重不增或略降，10d左右逐步好转。实验开始后，NC组大鼠体重逐渐增加，实验结束时体重为（235.24±2.88）g，与实验开始时体重［（195.97±3.09）g］相比，差异有统计学意义（P＜0.001）；CR组的体重也是从实验开始的（200.41±3.02）g逐渐增加到实验结束时的（220.77±2.34）g（P＜0.001）；实验结束时，CR组的大鼠体重与NC组相比有显著性差异（P＜0.05）（图1）。

二、两组大鼠腹部脂肪比较

实验结束时，CR组大鼠的腹部脂肪量为（3.86±0.22）g，明显少于 NC组大鼠［（5.51±0.18）g］（P＜0.01）。

三、两组大鼠卵巢的卵泡数变化

CR组和 NC组的初级卵泡［（25.2±1.4）vs.（21.9±0.9）］、次级卵泡［（18.0±0.8）vs.（20.5±1.4）］和闭锁卵泡数［（25.2±1.1）vs.（27.8±1.2）］均无统计学差异（P＞0.05）；但是CR组与NC组相比，原始卵泡数显著增多［（91.5±2.6）vs.（62.3±2.6）］，窦状卵泡数显著减少［（15.2±0.6）vs.（23.0±1.8）］（P＜0.01）。

四、免疫组织化学实验结果

SIRT1在卵巢组织中的卵母细胞和间质组织中均有表达，棕色或棕黄色颗粒可见于细胞浆和细胞核中。NC组卵巢中卵母细胞核内表达，部分强阳性，胞浆弱阳性，周边间质组织部分弱阳性；能量CR组中卵母细胞核强阳性表达，胞浆阳性表达，周边间质组织阳性表达（如箭头所指）（图2）。

图2 SIRT1蛋白在卵巢中的表达与定位（免疫组化ABC法，×200）

五、CR对大鼠卵巢组织中SIRT1蛋白表达的影响

Western blot检测显示，CR组大鼠卵巢组织中的SIRT1高表达，灰度值扫描值与对照组有显著性差异（P＜0.05）。

图3 免疫印迹法检测卵巢中SIRT1的表达

讨 论

1935年，McCay等［6］首次报道了CR能显著提高大鼠的平均寿命和最长寿命，后续对酵母、蠕虫、果蝇以及哺乳动物的实验陆续证明，在满足机体对各种营养素需要量的前提下，适当限制能量摄入，能明显延缓衰老的速度。过去的几十年中，美国威斯康星州国立灵长类动物研究中心（WNPRC）和国立卫生院（NIH）动物研究中心一直对延长灵长类动物的寿命进行CR的相关研究［7－8］，根据其研究结果，30%左右的CR以及18%的体重下降对于寿命的延长及健康的改善最为有效，因此本研究选用35%作为能量限制作为研究标准。

CR可减少与年龄相关的疾病的发生率在灵长类、人类实验中已有了初步的结果［9－11］。CR是唯一被科学界普遍公认的除遗传操作以外延缓衰老的调控手段，可促进脂肪动员，预防脂类代谢紊乱造成的许多疾病，最终延长寿命。了解CR引起这些效应的作用机制有助于指导人类的饮食和生活方式，起到延缓衰老、预防疾病发生的作用。

本研究中NC组大鼠体重在整个实验过程中持续增加，35%CR组大鼠在经历1周左右的体重不增后缓慢增长。CR组大鼠无营养不良表现，与实验开始时体重相比增加明显，但实验结束CR组的大鼠体重显著低于NC组，CR组腹周脂肪量明显小于NC组，说明减少过度的能量摄入使大鼠的体重减轻、体内脂肪量减少。同时CR组的原始卵泡数比NC组明显增多，窦状卵泡数减少，与Selesniemi等［12］的研究结果一致。由于卵巢的总卵泡数在胚胎时期就已经是确定的，不能再生［13］，原始卵泡的数目是女性的基本生殖单位也是卵巢储备的唯一形式［14］。当原始卵泡向着不同级卵泡成熟转化时，原始卵泡不断减少并最终耗竭殆尽。我们的实验结果表明CR可以阻止原始卵泡向成熟卵泡的转化，减少原始卵泡的消耗，保留卵巢的储备从而延长生殖寿命。

Sir2（silence information regulator 2）基因家族是一种保守的从古细菌到哺乳动物都存在的NAD＋（烟酰腺嘌呤二核苷酸）依赖的组蛋白／非组蛋白去乙酰基酶，对细胞的分化、代谢、衰老等生理活动都起着十分重要的调节作用［15］，是调节生物体衰老进程的一个重要基因，其不仅能从遗传角度影响寿命，还能从CR的代谢角度调节细胞寿命，被认为是CR介导发挥效应的一个关键调节因子［16－17］。研究发现，CR能够引起Sir2的表达上调，并且这一现象从低等生物酵母到高等生物如哺乳类动物、灵长类动物等都普遍存在［18］，哺乳动物共有7个Sir2同源基因（SIRT1～SIRT7），其中SIRT1与Sir2的同源性最高［19］。

由于人类寿命明显延长和婚育年龄的推迟，探索如何延长生殖寿命，延缓生殖系统衰老显得至关重要。我们实验研究中CR大鼠卵巢的SIRT1表达增强，卵巢的储备增加，提示SIRT1对于延缓卵巢衰老延长生殖寿命有积极的作用。在关于各种细胞功能的研究中，SIRT1对心脏［20］、胰腺［21］、脑血管［22］等均有保护作用，因此，SIRT1作为治疗不同疾病的靶点越来越被重视。随着研究的深入，它与疾病的相关性将给我们提供新的临床思路，SIRT1有可能作为特定作用靶点具有治疗潜能。

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