CDX2基因修饰的脐带间充质干细胞向杯状细胞分化的可行性研究

李毅，李欣，孙涛

1.第二军医大学 海军临床医学院；2.海军总医院 消化内科；北京 100048

溃疡性结肠炎是一种发病机制涉及遗传易感性、环境因素、免疫异常、肠道菌群改变等多方面的肠道慢性非特异性炎症，其确切病因尚未完全阐明，并且治疗上也仍有局限性。溃疡性结肠炎患者在病理上表现为结肠杯状细胞数量减少、肠隐窝破坏、病变部位黏膜粘液层变薄、肠道菌群发生改变[1-2]。这使得肠道内细菌更易直接损伤肠黏膜，肠道抗原更易造成黏膜免疫炎症反应。通过增加杯状细胞数目、增强杯状细胞分泌粘蛋白能力，有利于肠道黏膜屏障恢复及肠道保护。尾型同源盒2（caudal type homeobox 2，CDX2）基因是肠道上皮特异性基因，同时也是胚胎发育过程中促进限制内胚层向后肠发育的关键基因[3]。CDX2 还能特异性结合肠道黏液蛋白（mucin-2，MUC2）基因的启动子，促进MUC2 的表达。另一方面，脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）除具有多向分化能力外，已证明其可通过归巢效应到达肠道炎症部位。所以利用CDX2修饰UC-MSC，使之向杯状细胞分化或大量表达MUC2，对治疗溃疡性结肠炎具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

脐带组织来源于海军总医院妇产科。重组质粒CDX2-IRES-EGFP 由上海吉凯基因公司构建；TRIzol total RNA 试剂盒、无血清替代物KSR 购于Invitrogen 公司；PCR 反应试剂盒购于TaKaRa 公司；质粒大量提取试剂盒购于QIGENE 公司；DMEM 培养基及小牛血清购于Hyclone 公司；Activin A 与Wnt3a 购于PeproTech 公司；DNA 凝胶回收试剂盒购于Promega 公司；Xfect Adult Stem Cell 转染试剂购于Clontech公司。

1.2 UC-MSC的培养与鉴定

经孕妇知情同意，取剖宫产手术中足月产新生儿脐带30 cm 左右，在超净台中分离脐带血管与外膜间的胶冻样组织，将其剪成1 mm3大小，于37℃、5% CO2条件下原代培养10 d，待大量细胞从组织爬出后去除组织，用0.25%胰蛋白酶消化瓶底5 min，1000 r/min 离心5 min，将爬出细胞集中到4 个25 cm2培养瓶中继续培养，每2～3 d 换一次液，待细胞长到80%～90%融合时进行传代；取第3 代稳定增殖的UC-MSC，用胰蛋白酶消化5 min，1000 r/min 离心5 min 后用PBS 清洗2 次，细胞计数后悬浮于PBS溶液中，使细胞浓度为1.0×106/mL，分别加入鼠抗人单克隆抗体PE-CD45、PE-CD105、PE-CD73、PEHLA-DR、FITC-CD90、FITC-CD34 及PE-IgG2a、PE-IgG1K、FITC-IgG1K 同型对照抗体，常温避光孵育30 min，PBS洗涤2次后立即行流式细胞检测。

1.3 UC-MSC向内胚层方向诱导

在DMEM/F12 培养基中加入100 ng/mL 重组人Activin A、50 ng/mL Wnt3a、10% KSR、100 U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素，配成诱导培养基，将第2代细胞按1∶2 传代后，对其中一半数量的细胞采用诱导培养基持续培养5 d，另一半细胞仍以完全培养基培养。

1.4 RT-PCR 检测Sox17 与GATA4 在UC-MSC 中的表达

针对Sox17 及GATA4 设计引物行RT-PCR。Sox17 正向引物为5'-GTGGACCGCACGGAATTTG-3'，反向引物为5'-GGAGATTCACACCGGAGTCA-3'；MUC2 正向引物为5'-CGACACCCCAATCTCGA TATG-3'，反向引物为5'-GTTGCACAGATAGTGAC CCGT-3'。反应条件：94℃ 5 min 预变性，然后以94℃30 s、60℃30 s、72℃l min 行36个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。反应体系包括10×PCR 缓冲液2.5μL、dNTP 混合液1μL、正反向引物各0.25μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL、cDNA 1μL、ddH2O 19.75μL。

1.5 UC-MSC的转染

将经过诱导和未经诱导的第3代UC-MSC 以2×105接种到6 孔板中，其中单转组、空转组、对照组接种未经诱导的UC-MSC，单诱组、诱转租接种经过诱导的UC-MSC，每组3 孔，每孔加入2 mL 无抗生素的DMEM 完全培养基，待细胞长到60%～70%融合时对空转组、单转组、诱转组进行转染，转染操作按照Xfect Adult Stem Cell 转染试剂盒操作说明进行，37℃孵育4 h，然后吸出所有培养基并换之以2 mL新鲜培养基。

1.6 转染后细胞的荧光显微镜观察

分别于转染后24、48 h 在荧光显微镜下观察各组转染情况，随机计数5个视野的总细胞数和具有绿色荧光的细胞数。

1.7 RT-PCR 检 测CDX2 与MUC2 在UC-MSC 中 的表达

针对CDX2 及MUC2 设计引物行RT-PCR。CDX2 正向引物为5'-GACGTGAGCATGTACCCTA GC-3'，反向引物为5'-GCGTAGCCATTCCAGTCCT-3'；MUC2 正向引物为5'-ATGACAACGGACGAC A CAGAA-3'，反向引物为5'-TCAGCGTTTGAGTTTC CAGAG-3'。反应条件：94℃5 min 预变性，然后以94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 行36 个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP 混合液1μL、正反向引物各0.25μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL、cDNA 1μL、ddH2O 19.75μL。

1.8 UC-MSC 的内胚层诱导在CDX2 促进UC-MSC表达MUC2中的作用评价

用相对增长率R表示当CDX2 增加相同倍数时MUC2的表达增长率。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 UC-MSC流式细胞术检测

经流式细胞术检测，培养至第3 代的细胞CD105、CD90、CD73 均呈阳性表达，阳性率分别为97.4%、99.0%、97.8%，而HLA-DR、CD34、CD45 阳性率分别为0.7%、0.5%、0.3%（图1），所得细胞免疫表型符合间充质干细胞免疫表型特点。

2.2 内胚层细胞标志物Sox17、GATA4 的mRNA 表达

用重组人Activin A、重组人Wnt3a 诱导培养5 d，对诱导细胞行RT-PCR，结果Sox17 的mRNA 表达量升高54 倍（P＜0.05），GATA4 升高27 倍，两者变化均有统计学意义（P＜0.05）。凝胶电泳（图2）显示，诱导组标志基因Sox17、GATA4 的条带均比未诱导组明显。

2.3 荧光镜检转染后细胞荧光表达情况

单转组、空转组、诱转组在48 h 后均见绿色荧光蛋白表达，其中空转组荧光强度较强，可见荧光细胞较多，转染效率约70%；单转组与诱转组荧光强度较弱，转染效率分别约为30%和40%。对照组、单诱组细胞生长状态较好，荧光镜下未见绿色荧光表达。5 组细胞形态均为长梭形或不规则形，排列呈漩涡状，未见圆形杯状细胞或类杯状细胞。见图3。

2.4 RT-PCR检测CDX2与MUC2的mRNA表达

瞬时转染后48 h，对5 组细胞行RT-PCR，结果如图4，与对照组相比，单转组UC-MSC 表达CDX2水平升高113.3 倍，MUC2 表达升高30.2 倍；诱转组UC-MSC 表达CDX2 水平升高196.7 倍，MUC2表达升高98.8 倍，空转组、单诱组CDX2 与MUC2 无显著改变。凝胶电泳（图5）提示诱转组条带最清晰，其次是单转组、空转组与单诱组，对照组未见明显条带。

2.5 单转组与诱转组MUC2增长情况比较

单转组MUC2 相对增长率R=26.7%，诱转组MUC2 相对增长率R=50.2%。经两独立样本t检验，MUC2相对于CDX2的增长率，诱转组显著高于单转组（P＜0.05）。说明在CDX2 增长倍数相同的情况下，经过诱导的UC-MSC 表达的MUC2 量更多，且具有统计学意义。

图1 UC-MSC的流式细胞检测结果

3 讨论

图2 Sox17与GATA4的PCR产物凝胶电泳

CDX2是一种在肠道黏膜特异性表达的基因，它也是胚胎发育过程中促进内胚层向后肠发育的关键基因，在胚胎发育过程中多种途径促进内胚层向后肠分化最终都集中到对CDX2 的控制[3-4]。从胚胎发育的第8周开始，胎儿的胃肠道即可检测出CDX2表达，在人体正常上皮细胞中，CDX2 可表达于内胚层来源的肠道上皮及胰腺导管和腺泡上皮，但CDX2在食管和正常胃黏膜上皮中不表达。除消化系统外，其他各系统正常上皮内也检测不到CDX2[5]。CDX2 在肺、食管、胃激活后组织会向肠上皮组织化生[6]。CDX2 修饰的食管上皮细胞还可以表达肠道粘蛋白MUC2，这也是Barrett 食管中能见到杯状细胞的原因。其主要机制可能是：①CDX2通过促进无调同源物-1（atonal homolog-1，ATOH1）表达上升促进MUC2 的表达[7]；②CDX2 直接与MUC2 的启动子相互作用，启动MUC2 表达[8]。由于CDX2 是肠道上皮细胞分化关键基因，同时又有直接激活粘蛋白MUC2 的作用，所以我们选择CDX2 作为UC-MSC 的修饰基因。本实验中UC-MSC 在诱导培养5 d 后，RT-PCR 结果显示Sox17 表达升高54 倍，GATA4 表达升高27 倍。说明诱导培养促进了UC-MSC 向内胚层细胞的分化。实验中，单转组、诱转组、空转组均进行了转染，荧光显微镜下均能看到荧光蛋白表达，但单转组与诱转组荧光较弱，空转组荧光较强。其原因可能是：①UC-MSC 对转染试剂的敏感性低，转染效率受到限制；②由于转染试剂毒性影响了细胞活力，对质粒蛋白表达有较大影响；③诱转组与单转组实质上是CDX2与绿色荧光蛋白（EGFP）通过内部核糖体进入位点（IRES）实现的双基因共表达，在总体转染效率受限的情况下，IRES 片段下游的EGFP表达效率还会下降60%以上，进一步减弱了视野下荧光蛋白的荧光量。RT-PCR 结果显示，单纯转染组CDX2 表达量上升了113 倍，MUC2 上升了30倍，这进一步说明CDX2 对杯状细胞标志蛋白即粘蛋白MUC2 表达的直接促进作用，同时证明了经CDX2 修饰的UC-MSC 有向成熟杯状细胞分化的可能性，而且在细胞治疗领域，经CDX2 修饰的UCMSC 可作为修复UC 患者黏液层的可选细胞。另一方面，单诱组CDX2 与MUC2 表达无明显改变，说明Activin A 与Wnt3a 诱导培养对内源性CDX2 与MUC2 的增加无影响，CDX2 的表达是MUC2 表达的必需因素。诱转组CDX2 与MUC2 表达分别升高了197 与99 倍，说明可能经过Wnt3a 与Activin A 诱导后，UC-MSC 对转染的敏感性提高，CDX2 表达随之上升。值得注意的是，MUC2随CDX2上升的过程并非等比例，经诱导处理的UC-MSC 的MUC2 相对增长率显著高于单纯转染CDX2 的UC-MSC。这说明在过表达CDX2 的前提下，对UC-MSC 的诱导培养也是促进MUC2 上升的因素，也就是说，对UC-MSC向内胚层细胞的诱导有利于MUC2 的表达。其机制可能是MUC2 的表达除受CDX2 的直接调控外还受其他基因控制，而把UC-MSC 向内胚层诱导后，能促进MUC2 表达的其他调控基因表达也增强，从而进一步增加MUC2 的表达。本实验虽然增加了UCMSC 表达杯状细胞标志物MUC2，但并未观察到典型的杯状细胞形态，转染48 h 的细胞仍以长梭形或多边形为主，考虑原因主要是：①虽然经过诱导及基因修饰，MUC2 的表达显著上升，但由于MUC2 基础水平较低，所以仍达不到杯状细胞产生所需的MUC2量；②实验仅对MUC2的变化在mRNA 水平进行探讨，缺少蛋白水平，所以并不能证明MUC2 蛋白的产生确实升高。因此，要想得到典型的杯状细胞，还须优化实验条件。本实验结果说明，在UC-MSC中过表达CDX2 能够增加杯状细胞标志物粘蛋白MUC2 的表达，而事先诱导UC-MSC 向内胚层细胞分化，能进一步增加MUC2 的表达，但要得到典型杯状细胞或更大量的MUC2还须优化实验条件。

图3 荧光镜检转染后细胞荧光表达情况（100×）

图4 各组细胞CDX2与MUC2的mRNA表达情况

图5 CDX2与MUC2的PCR产物凝胶电泳

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