结肠杯状细胞染色的结果比较研究*

高琛琛 薛晓伟 刘玥宏 李利生 徐敬东

(1. 首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系, 北京 100069)(2. 北京协和医院病理科,北京 100005)(3.首都医科大学宣武医院,北京 100054)(4.首都医科大学基础医学院机能实验中心，北京 100069)

组织学评价和免疫组织化学特征在生理学研究中非常重要，因而在保持组织标本完整性和紧密性的基础上选择适当的固定方法很关键。常用的组织固定液有卡诺液，Susa液，Helly干液，4%多聚甲醛，Bouin液等[1]。研究表明，结肠杯状细胞内含有大量的黏液颗粒，内含黏蛋白分泌入肠腔，并在黏膜表层形成一层致密黏液层，作为肠道重要黏膜屏障之一，与其它细胞及不同机制共同参与维持肠道稳态[2]。基于此，本实验通过对大鼠结肠杯状细胞的数量、着色度的观察与分析来对比不同标本分别用卡诺液与甲醛固定液对黏液固定和着色度的区别。

1 材料与方法

1.1 实验动物

正常SD大鼠与便秘模型大鼠，6周龄，体质量220～250 g，SPF级，购于首都医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(京)2016-0001。

1.2 主要试剂

卡诺液，甲醛固定液，HE染液，高碘酸希尔法阿尔新蓝染液。

1.3 便秘模型大鼠的制备

在常规饮食、环境、周龄等其他条件相同的基础上，将用于模型制备的大鼠以地酚诺酯(长春长红制药有限公司，国药准字H22022037)70 mg/kg体质量的浓度溶于1 mL生理盐水，灌胃，每日1次，持续2周，致使其出现大便秘结，粪便数量减少，含水量减少等便秘症状。

1.4 大鼠结肠标本的制作

将大鼠麻醉后取结肠组织，立即投入固定液，分别用卡诺液与甲醛固定液处理后通过脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤得到组织蜡块，经修整切片(4 μm)后，分别用HE染液、高碘酸希尔法阿尔新蓝染液染色固封得到结肠石蜡切片标本，使用NikonDS-U3观察结肠杯状细胞和黏液细胞的形态学；取结肠放入质量分数为2.5%的戊二醛(pH7.2)中固定5 min后取出组织，切成1 mm3组织块继续固定。常规乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，超薄切片(50 nm)，醋酸双氧铀硝酸铅染色，透射电镜(Hitachi，HT7700 日本)观察结肠杯状细胞和黏液细胞的超微结构并拍片。

1.5 结肠组织标本的观察与杯状细胞指标统计

1.5.1杯状细胞的形态学观察：通过Nikon DS-U3显微镜分别以×20、×100视野观察正常大鼠与便秘模型大鼠的结肠标本，并对比两种固定方法和染色技术处理后杯状细胞形态和杯状细胞内黏液颗粒及黏蛋白的分泌情况。通过电镜进一步观察结肠黏液层的结构特点。

1.5.2统计指标的统计：用NIS-Elemets BR4.10软件，通过颜色强度设定统计8个不同视野下杯状细胞的数量和着色度，所有结果均使用prism6.0软件进行分析，数据表示为均数±标准误(Mean±SEM)，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 杯状细胞的形态学观察

光镜下，高碘酸希尔法阿尔新蓝染液染色结肠标本上皮组织中充满大量杯状细胞，边界清晰，胞内布满红染的黏液颗粒，亦可见被喷向肠腔的黏液(见图1，A1、A2和B1、B2)；用卡诺液固定、高碘酸希尔法阿尔新蓝染液染色的标本杯状细胞着色度明显强于甲醛固定液处理标本的杯状细胞(见图1，B1、B2和C1、C2)；甲醛固定液处理、HE染色标本的杯状细胞成空泡状，胞核被染成深蓝色，位于细胞底部，(见图1，D1、D2)。电镜下，便秘模型大鼠相比于正常大鼠，结肠黏膜表层黏液层变薄，分子筛样[3]作用减弱，细菌易位，接近甚至直接接触肠道黏膜上皮细胞，提示便秘模型的结肠黏液层与正常相比变薄且不完整(见图2，A、B)。

2.2 杯状细胞数量及着色度的比较

高碘酸希尔法阿尔新蓝染色标本中，如图3，4和表1所示，与正常大鼠相比，便秘模型大鼠的杯状细胞数量减少13.81%(P<0.05,见图3A)，而其着色度显著性增强(P<0.001,见图3B)。便秘模型大鼠结肠标本中，卡诺液处理与甲醛固定液处理的标本相比，杯状细胞数量无显著性差异(P>0.05,见图4A)，但着色度明显增强(P<0.05,见图4B)。结果提示，卡诺液处理与甲醛固定液处理的正常大鼠结肠标本的杯状细胞数量及着色度对比结果无显著性差异，而便秘模型组杯状细胞数量无显著性差异，但是着色度有显著性差异。

表1 正常与便秘模型大鼠结肠杯状细胞数量和着色度比较Table 1 Comparison of the number and color intensity of normal and constipation models colon goblet cells

注：与正常组比较，*P<0.05，***P<0.001.与甲醛固定液处理组比较，**P<0.01

Note：compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.Compared with the formaldehyde fixative fixed group，**P<0.01

图3 正常与便秘模型大鼠结肠杯状细胞的特征比较注：A.结肠陷窝内含有杯状细胞的数量对比；B.杯状细胞着色度的对比。与正常组比较，* P<0.05，***P<0.001.Fig.3 Comparison of the characteristic of colon goblet cells of normal and model rats Note：A. Comparison of the number of goblet cells along colonic depth. B. Comparison of percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.

图4 不同固定液处理的组织杯状细胞特性比较注：A.杯状细胞数量的对比；B.杯状细胞着色度的对比,与正常组比较，**P<0.01.Fig.4 Comparison of the characteristic of colon goblet cells treated with different fixative Note:A. Comparison of the number of goblet cells. B. Comparison of the percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，**P<0.01.

3 讨论

肠黏膜与免疫屏障、肠道共生菌群、营养和代谢产物等相互作用共同维持肠道稳态[4]。由肠道杯状细胞分泌的黏蛋白是肠道固有免疫第一防线黏液层的主要组成部分[5]，其中由杯状细胞分泌的黏蛋白和一些其他活性物质构成的肠道黏液层，为肠道抵御内源或外源性的刺激和微生物的侵袭提供了保障[6]，并有助于维持肠道共生菌群的平衡[7]。因此，杯状细胞是维持肠道健康必不可少的保护者。研究表明[8]，杯状细胞黏液必须伴随水分的扩散分泌入肠腔，本实验用以制备便秘模型大鼠的地芬诺酯，可以阻滞肠黏膜上的水通道，消除肠黏膜的蠕动反射而减弱肠蠕动，并使肠内容物通过延迟，肠腔内水分的吸收增加，肠道内的水分减少，所以，便秘模型大鼠结肠杯状细胞与正常大鼠相比，不仅数量减少，而且黏液分泌减少，胞内黏液颗粒密度增高，着色度加深，结肠黏液层厚度变薄，容易引起细菌易位(如图2所示)。由此可见，杯状细胞分泌的黏蛋白对于维持肠道稳态不可或缺。另有研究表明[9]，结肠肠道杯状细胞分泌的黏蛋白主要为MUC2黏蛋白，实质为高度糖基化的糖蛋白，具有水溶性，这可能就是因为用4%多聚甲醛处理标本，致使表层黏液蛋白溶解其中，导致组织标本中的黏蛋白含量降低，使其着色度降低；而卡诺液是由无水乙醇：氯仿：冰醋酸(6∶3∶1)组成，其不含蒸馏水[1]，可以完整地保存了标本杯状细胞及结肠黏液层中黏液蛋白含量，因而能够看到黏膜表面红染的黏液层。因此，在杯状细胞的形态学及黏液分泌的观察中，用卡诺液处理标本优于甲醛固定液。

综上所述，本实验通过对杯状细胞形态学观察以及数量与着色度的统计，结果提示卡诺液与甲醛固定液处理标本的差异性。从而应该注意的是，在不同实验，不同标本的制备中，对于固定液的选择应根据实验研究对象的特性而确定，同时，不可忽视应用不同固定剂处理标本，实验得到的数据可能有差异性。因此，要观察结肠黏液分泌的标本时，相较于甲醛固定、HE染色方法，卡诺液固定、高碘酸希尔法阿尔新蓝染色处理标本的方法更为合适。