PC-1解除S6K对AKT信号通路的负反馈抑制

张晓清 ，王健，王洪涛，李山虎，王芃，黄芳，洪鎏，邓楚中，周建光

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.贵阳医学院，贵州 贵阳 550004

前列腺癌是男性生殖系统常见恶性肿瘤之一，在欧美国家其发病率居首位，死亡率高居第二位[1]。PC-1/PrLZ基因是癌基因D52家族成员，其在雄激素非依赖性前列腺癌C4-2 细胞中高表达而在雄激素依赖性LNCaP 细胞中低表达，且随着前列腺癌分级的增加表达上升[2-3]。研究发现，PC-1 可以激活PI3K/AKT 信号通路，进而抑制雄激素，剥夺对前列腺癌细胞的凋亡诱导作用[4-5]。PI3K/AKT 信号通路可以通过调节细胞凋亡、细胞增殖、促进血管生成和肿瘤发育等促进前列腺癌雄激素非依赖进展，而PC-1如何激活该信号通路还不清楚。

我们利用慢病毒系统建立了过表达和干扰PC-1表达的前列腺癌细胞模型，在此基础上发现PC-1可以抑制mTOR 激酶信号通路下游分子S6K 的活性，进而解除了S6K对AKT的负反馈抑制功能，从而激活AKT激酶的活性。

1 材料与方法

1.1 材料

293T、LNCaP 及C4-2 细胞，大肠杆菌DH5α，PC-1基因真核表达质粒pCDNA-HA-PC-1，慢病毒包装辅助质粒由本室保存；DMEM 及RPMI1640培养基购自GIBCO 公司；优等胎牛血清（FBS）为Hyclone公司产品；慢病毒过表达载体pCDH-EF1-Myc-MCS-T2A-Puro和干扰表达载体pSIH1-H1-Puro 由金蕊博士馈赠；限制性内切酶、Pfu酶和DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；质粒提取、胶回收和PCR 回收试剂盒，转染试剂VigoFect 均为维格拉斯公司产品；聚凝胺（Polybrene）、嘌呤霉素购自Santa Cruz 公司；PC-1 多克隆抗体由本室自制；γ-tubulin 及抗S6Kp389、S6K、AKT、p308-AKT 抗体购自Cell Signaling公司；蛋白酶抑制剂购自Sigma 公司；雷帕霉素、RAD001和AG1024购自Selleck公司。

1.2 短发夹RNA（shRNA）慢病毒重组质粒的构建与鉴定

PC-1的shRNA 靶点为GCTATCTCTACTTGTC TCC，以此设计shRNA 正义链序列（5'-GATCCGCT ATCTCTACTTGTCTCCCTTCCTGTCAGAGGAGACA AGTAGAGATAGCTTTTTG-3'）和反义链序列（5'-AATTCAAAAAGCTATCTCTACTTGTCTCCTCTGAC AGGAAGGGAGACAAGTAGAGATAGCG-3'）。用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切shRNA 表达载体pSIH1-H1-Puro，回收后与退火的PC-1shRNA 片段连接，构建PC-1shRNA 慢病毒重组质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送上海英骏生物技术公司测序鉴定。

1.3 PC-1过表达慢病毒重组质粒的构建

PC-1基因正向引物为5'-ACGGATCCGATTGT AGAGAGATGGAC-3'，反向引物为5'-GAGCGGCC GCCAGGCTCTCCTGTGTCTT-3'。以pcDNA-HAPC-1 为模板，PCR 扩增并切胶回收PC-1基因DNA片段；分别将载体pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro和PC-1回收片段用BamHⅠ/NotⅠ于37℃双酶切12 h，酶切产物切胶回收后于16℃连接12 h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆提取质粒，用BamHⅠ/NotⅠ双酶切鉴定。

1.4 慢病毒的包装

适量293T 细胞接种于100 mm 培养皿，约24 h后转染，包装4种质粒慢病毒，即PC-1shRNA、其对照载体pSIH1-H1-Puro、过表达PC-1载体和对照载体pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro。将4 种质粒分别与3 个包装质粒（REV，VSVG，RRE）在空白DMEM 中混合，加入VigoFect 转染试剂混匀后室温静置20 min，分别加入4 皿细胞培养液中，37℃孵箱培养12 h 后，换成含10% FBS 的RPMI1640 培养液，48 h 后收集上清，经0.45μm 滤膜过滤即得包装好的病毒，直接加到待感染细胞中或于-80℃保存。

1.5 前列腺癌细胞系的建立

接种LNCaP、C4-2细胞于100 mm 培养皿中，用含10% FBS 的RPMI1640 培养液培养，24 h 后加入包装好的含有过表达PC-1及其对照载体、敲低PC-1表达及其对照载体的4种病毒液，同时加入终浓度为5μg/mL 的Polybrene，病毒感染10 h 后换成普通培养液，48 h后传代，传代时培养液里加入2μg/mL嘌呤霉素筛选，进一步培养鉴定。

1.6 Western印迹分析

收集细胞，提取总蛋白，将蛋白提取液与5×SDS上样缓冲液以4∶1 的体积比混匀，煮沸10 min 后离心，取样进行SDS-PAGE 后，电转移至硝酸纤维素膜上；将膜用5%脱脂奶粉于室温封闭30 min；加入所需一抗于室温孵育1 h 或4℃过夜后，TBST 洗膜3次，每次7 min；用相应的二抗孵育后，洗膜3 次，每次5 min；用化学发光法压片显影。

2 结果

2.1 建立过表达PC-1 的LNCaP 稳定细胞系及敲低PC-1表达的C4-2稳定细胞系

包装慢病毒后分别感染前列腺癌LNCaP和C4-2 细胞，嘌呤霉素筛选后收集细胞，提取总蛋白，Western 印迹检测细胞内PC-1 的表达水平，结果见图1。相对于各自对照细胞，LNCaP 细胞中的PC-1蛋白表达水平明显上升，而感染PC-1shRNA 慢病毒C4-2 细胞中的PC-1 蛋白表达水平明显下降，表明稳定细胞系构建成功。

2.2 PC-1抑制前列腺癌细胞中S6K激酶的活性

为检测PC-1 是否影响AKT 信号通路下游mTOR信号通路活性，我们检测了细胞内S6K-p389、70S6K 表达水平。结果表明LNCaP 细胞中PC-1 过表达对总蛋白表达水平没有影响，但抑制其磷酸化水平（图2A）；在C4-2细胞中，敲低PC-1表达使S6K磷酸化水平上升（图2B），对总蛋白水平没有影响。提示PC-1能够调控S6K激酶的活性。

为进一步证实这一结果,我们用不同浓度的mTOR 抑制剂雷帕霉素平行处理这4 种细胞，24 h后提取细胞总蛋白进行Western 印迹检测。结果显示（图2C），雷帕霉素呈剂量效应型抑制S6K-p389水平；而PC-1 高表达能够增强雷帕霉素对S6Kp389 的抑制作用，敲低PC-1 表达能够抑制雷帕霉素对S6K-p389的抑制作用。进一步表明PC-1能够抑制前列腺癌细胞中S6K激酶的活性。

2.3 PC-1 解除S6K 激酶对AKT 激酶活性的负反馈抑制

图1 PC-1过表达及敲低表达前列腺癌稳定细胞系的鉴定

图2 PC-1调控前列腺癌细胞中S6K激酶的活性

图3 PC-1解除S6K负反馈调控AKT信号通路

LNCaP、LNCaP-PC-1 细胞中S6K和AKT 磷酸化水平检测结果见图3。PC-1过表达时S6K 磷酸化水平下降，而AKT的磷酸化水平上升；当用mTOR抑制剂RAD001 处理细胞完全抑制S6K 的活性后，PC-1过表达和对照细胞中AKT 的磷酸化水平相当。提示PC-1可能通过抑制S6K 活性，解除S6K 对AKT 激酶活性的负反馈抑制作用，进而上调AKT活性。

3 讨论

AKT信号通路在肿瘤细胞中异常激活导致细胞的表型恶性转化，mTOR 蛋白激酶是PI3K/AKT 信号通路下游的重要组分。mTOR 信号通路主要包含2个蛋白复合体mTORC1和mTORC2。mTORC1 通过调控它的2 个底物分子S6K和4E-BP1 来调控细胞的大小和蛋白质翻译；mTORC2 参与了对AKT 第473氨基酸残基的磷酸化调控[6-7]。

mTOR 依赖的S6K 磷酸化激活参与了蛋白质的翻译起始和延伸，但该分子的激活又启动了一条负反馈通路抑制AKT 信号通路活性[8]。我们首先发现过表达PC-1 在前列腺癌细胞中能够激活AKT 信号通路，同时能抑制S6K 的磷酸化水平，提示PC-1 可能解除了S6K对AKT活性的负反馈抑制作用。雷帕霉素及其衍生物RAD001 是mTOR 信号通路的有效抑制剂，能抑制其下游底物分子如S6K 的活性。用RAD001 处理PC-1 过表达及对照LNCaP 细胞，当S6K 活性被完全抑制后，PC-1 对AKT 激酶的激活作用消失，提示PC-1对S6K 激酶活性的调控参与了其对AKT活性的调控。

本研究表明PC-1 通过抑制mTOR 信号通路下游分子S6K 激酶的活性，解除了S6K 对AKT 信号通路的负反馈抑制，从而激活AKT 信号通路。这一结果揭示了PC-1激活AKT活性的可能分子机制。

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