肺炎支原体黏附蛋白P30的高效表达及初步应用

王成红 ，于传亭，张奇舒，李鹏飞，王晓丹，修冰水，张贺秋

1.烟台市烟台山医院 检验科，山东 烟台 264000；2.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是儿童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物[1]，由其引起的临床症状同其他病原体相似，但临床用药并不相同[2]，因此，研制灵敏、特异、便捷的快速早期诊断试剂，对于Mp感染的诊断和治疗意义重大[3]。

肺炎支原体M129 株的全基因测序工作于1996年完成。M129 基因组全长816 kb，编码超过400 个功能蛋白[4]。其中P30 蛋白是锚定于Mp 细胞膜上的重要黏附蛋白，包含275 个氨基酸残基，相对分子质量约为29.7×103，其基因序列全长825 bp。研究显示P30 蛋白可以激起宿主的免疫反应[5]，是除了黏附蛋白P1 外的另一个重要的黏附素和免疫原。由于Mp采用的是偏性密码子，其野生基因不适合在大肠杆菌中进行表达。为此，我们利用生物信息学方法和密码子优化技术设计并获得优化的Mp 黏附蛋白P30基因序列，实现了其在大肠杆菌中的高效表达。

1 材料和方法

1.1 材料

Mp 患者血清样本来自烟台山医院小儿科住院病人，正常人血清样本来自烟台山医院体检中心。

TaqDNA 聚合酶为北京百泰克生物技术有限公司产品；T4DNA 连接酶为TaKaRa 公司产品；DNA限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ购自Promega 公司；PCR 产物回收试剂盒由北京百泰克生物技术有限公司生产；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；DNA序列测定由中美泰和生物技术有限公司完成。

1.2 判定标准

样品与未致敏粒子（最终稀释率1∶20）的反应图像判定为（-），而与致敏粒子（最终稀释率1∶80）的反应图像判定为（+），则结果判定为阳性。将显示反应图像为（+）时的最终稀释率作为抗体滴度。

1.3 抗原表位分析

从NCBI 网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下载P30 黏附蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列，采用Biosun 生物软件比对序列，分析P30 的抗原表位情况，确定克隆表达的优势抗原表位区间。

1.4 肺炎支原体P30黏附蛋白基因的密码子优化与基因合成

采用Genscript 软件在线分析P30 基因的密码子表达情况；采用自编软件，根据P30 优势抗原表位的氨基酸序列，设计并优化由大肠杆菌优势密码子组成的P30 基因，分段设计并合成引物，采用退火PCR方法合成各基因片段，利用基因片段末端重复序列将各片段搭桥扩增，最终得到完整的P30优化基因。

1.5 原核表达载体的构建

利用分别含XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点的上游引物P30F-XhoⅠ（GCCTCGAGGCCCTCATTGTTC）、下游引物P30R-XbaⅠ（GCTCTAGATTAACGCTTCGG T）对上述基因进行PCR 扩增，从而在基因片段两端引入酶切位点，经双酶切回收后插入同样经XhoⅠ、XbaⅠ酶切的原核表达载体pBVIL1-His，转化大肠杆菌HB101，挑选阳性克隆，振荡培养过夜后42℃诱导表达，SDS-PAGE鉴定，对高表达菌株测序。

1.6 抗原表达与纯化

鉴定出的阳性克隆于37℃培养过夜后转至新鲜的LB 培养基，37℃培养2～3 h，至D600nm值为0.4～0.6，42℃水浴诱导表达5 h，离心收集菌体，用TE 缓冲液冲洗菌体并悬起，超声波破碎细胞，离心收集上清，用Ni 柱分离纯化融合蛋白IL1-P30，收集洗脱峰，SDS-PAGE鉴定各步分离产物。

1.7 间接ELISA法评价IL1-P30融合蛋白的抗原性

以纯化的IL1-P30 融合蛋白包被酶联板，用间接ELISA 法对肺炎患者和正常人血清样本进行测定，根据D450nm值计算S/c，评价重组抗原的反应活性。

2 结果

2.1 肺炎支原体P30黏附蛋白的表位分析

运用Biosun 生物软件分析比对肺炎支原体P30黏附蛋白的氨基酸序列（GenBank：M57245.1），结果显示，除75～95 aa区段抗原性较弱外，整个P30蛋白具有较强的抗原性（图1）。

2.2 肺炎支原体P30黏附蛋白基因的密码子优化和获取

野生型P30 基因全长825 bp，由275 个密码子编码相应的氨基酸序列。采用Genscript软件对野生Mp基因进行密码子分析显示，约13%的密码子表达效率低于30%，属于稀有密码子，密码子适应指数（CAI）为0.59（图2A），属于Genscript 软件中定义的难于表达的基因。采用自编程序对P30 密码子基因优化后，稀有密码子比率仅为3%，CAI 提高到0.84，属于Genscript软件中定义的易表达基因（图2B）。

采用重叠延伸PCR 方法分4 段分别扩增基因片段，而后相邻片段末端搭桥退火延伸，最终获得全长825 bp 的目的基因，测序结果显示获得的基因序列正确。

图1 肺炎支原体P30黏附蛋白氨基酸序列抗原表位预测

图2 P30基因密码子分析

2.3 抗原表达与纯化

大量诱导表达测序正确的表达菌株，超声波破碎后SDS-PAGE鉴定，IL1-P30融合蛋白为包涵体表达，相对分子质量为43.5×103，与预期相符（图3）。

2.4 间接ELISA法评价IL1-P30融合蛋白的抗原性

用纯化的IL1-P30 融合蛋白包被酶联板，用间接ELISA 法初步检测了47 例正常人和85 例肺炎支原体患者的血清。结果70 份患者血清检出阳性，42例正常人血清反应阴性，灵敏度和特异性分别为82.35%和89.36%（图4A），ROC 分析显示曲线下面积（AUC）为0.9088（图4B），证明IL1-P30 融合蛋白有较好的抗原活性和特异性。

3 讨论

Mp 的早期诊断对疾病的治疗具有重要意义。由于Mp采用偏性密码子，在大肠杆菌中表达较为困难，因此临床应用较广的Mp检测试剂如日本富士冷凝集法和欧蒙试剂均采用灭活的Mp 全菌体提取的膜抗原，工艺复杂，且由于含有大量非活性成分导致试剂的灵敏度低、特异性差。因此，克隆表达的Mp抗原对肺炎支原体的诊断具有重要意义。

在Mp基因组表达的数百种抗原中，研究较多的是黏附蛋白P1，由于其特殊的定位及在致病中的重要作用而成为研究热点。我们在研究中发现，P1 蛋白虽具有很好的抗原性，但仅靠P1 进行检测不能覆盖所有患者，提示除了P1 抗原外，还存在其他重要的抗原表位[6]。Varshney 等克隆表达了P30 抗原，用ELISA 法检测融合蛋白与Mp 患者血清的反应，测得其灵敏度和特异性分别为78.57%和89.47%[4]，但由于其采用的基因为野生型基因，表达量较低，限制了在诊断和疫苗研制中的应用。

本研究采用密码子优化结合退火延伸PCR 技术，获得了CAI 为0.84 的优化的P30 基因，并实现了P30抗原的高效重组表达，表达后的P30抗原具有很好的灵敏度和特异性。这为P30 抗原在Mp 检测和疫苗中的应用奠定了基础。

图3 优化P30基因的表达

图4 P30抗原活性的ELISA鉴定（A）及其特异性分析（B）

[1]Montagnani F,De Paolis F,Beghetto E,et al.Use of recombinant chimeric antigens for the serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection[J].Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(11):1377-1386.

[2]袁壮.肺炎支原体肺炎的诊治[J].中国实用儿科杂志,2008,23(8):561-572.

[3]Drasbek M,Nielsen P K,Persson K,et al.Immune response to Mycoplasma pneumoniae P1 and P116 in patients with atypical pneumonia analyzed by ELISA[J].BMC Microbiol,2004,5:4-7.

[4]Himmelreich R,Hilbert H,Plagens H,et al.Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae[J].Nucleic Acids Res,1996,24(22):4420-4449.

[5]Varshney A K,Chaudhry R,Kabra S K,et al.Cloning,expression,and immunological characterization of the P30 protein of Mycoplasma pneumonia[J].Clin Vaccine Immunol.2008,15(2):215-220.

[6]张奇舒,修冰水,宋晓国,等.密码子优化的肺炎支原体P1 蛋白在大肠杆菌中的克隆表达[J].生物技术通讯,2012,23(3):380-382.