甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展

谭伟，谢芝勋

广西壮族自治区兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西 南宁 530001

流感病毒属于正粘病毒科，根据其基质蛋白（matrix protein，M）和核蛋白（nucleoprotein，NP）的不同，流感病毒分为甲、乙、丙共3 型[1-2]。季节性流感主要由甲型流感病毒H1、H3 亚型及乙型流感病毒所引起，不同年龄段的人群都可感染，特别是老人、婴幼儿、免疫功能有缺陷的病人及慢性病患者更易感且发病症状较重，全世界每年有25～50 万人死于季节性流感[3-4]。人甲型流感病毒于1933 年首次分离成功[1]，1945 年第一个商品化人用流感灭活疫苗在美国投放市场[5]，不久又研制出流感病毒减毒活疫苗[1]。流感灭活疫苗通过肌肉内接种，主要诱导产生体液免疫；而流感病毒减毒活疫苗则经鼻腔内喷雾接种，同时诱导产生体液免疫和细胞免疫。

目前市场上的季节性流感疫苗包括人甲型流感病毒H1N1 亚型和H3N2 亚型的血凝素（haemagglutinin，HA）及乙型流感病毒的HA 三价苗[6]，在北美地区和我国主要采用三价疫苗，但也有一些国家和地区使用单价苗。季节性流感疫苗具有高度特异性，即对相同亚型的流感毒株预防效果良好，而对不同亚型流感毒株的预防效果则不理想。由于流感病毒的HA 蛋白易于发生抗原变异[7]，常会导致流感疫苗生产株与流行株的抗原性不一致，使疫苗起不到保护作用。生产季节性流感疫苗需要每年春季根据各地流感病毒流行株的监测数据和分析结果，预测在当年冬季可能出现的流感病毒流行株，并筛选出相应的流感毒株来制备疫苗。传统的流感疫苗生产周期长、工艺复杂，且生产能力受不含特定病原体（specific-pathogen free，SPF）鸡胚供应量的限制。此外，易感人群每年都要接种新的疫苗来预防季节性流感，且老年人的疫苗接种效果常欠佳[6]。流感灭活疫苗的免疫保护期短、不易刺激产生细胞免疫，无法预防流感病毒变异株引发的全球性流感。因此，人们期望能研发出一种流感通用疫苗来预防所有亚型流感病毒的感染，并解决上述一系列难题。我们将介绍基于M2e短肽的甲型流感病毒通用疫苗的研究进展。

1 甲型流感病毒通用疫苗的概念

目前广泛使用的季节性流感疫苗主要预防H1、H3亚型的甲型流感病毒和乙型流感病毒的感染，而不能预防其他亚型的甲型流感病毒（如H5、H7和H9等亚型）的感染，因此，流感通用疫苗的理念应运而生[8-9]。甲型流感病毒通用疫苗利用不同亚型流感病毒含有的共同抗原表位诱导产生交叉免疫保护反应，来预防所有亚型流感病毒的感染。流感通用疫苗还可以避免每年筛选流感疫苗生产株的麻烦，降低疫苗的生产成本。

理想的甲型流感病毒通用疫苗应能诱导产生针对所有亚型流感病毒的保护性免疫，包括体液免疫和细胞免疫。因此，用于流感病毒通用疫苗的免疫原应含有能引起交叉保护反应的B 细胞和T 细胞抗原表位。目前用于甲型流感病毒通用疫苗研发的免疫原主要包括流感病毒的M2 离子通道蛋白、M2 蛋白的外膜区（M2e）、HA蛋白的茎部区、NP蛋白、酸性聚合酶（PA）和基质蛋白（M1）等[3]，这些病毒蛋白含有相对保守的氨基酸序列，可以诱导产生交叉免疫保护反应。

1.1 M2e短肽流感通用疫苗的研究

M2e 短肽是流感病毒M2 蛋白暴露于外膜的部分。M2 蛋白最早是由Lamb 等于1981 年发现[10]，它镶嵌于流感病毒囊膜中，形成受pH 调控的质子通道，并参与病毒脱壳及新生病毒子粒的装配和释放过程[11-12]。起初研究者利用M2蛋白作为通用疫苗的免疫原[13]，但M2是膜蛋白，由97个氨基酸残基组成，相对分子质量较大，不易分离纯化；而M2e短肽只有24 个氨基酸残基，分子较小，溶于水并易于纯化，因此M2e短肽更适合作为流感通用疫苗的免疫原。

图1 来源于人、禽和猪流感病毒的M2e短肽序列

M2蛋白的N端含有24个氨基酸残基，暴露于病毒囊膜表面或感染细胞的表面，与新生病毒颗粒的装配有关，被称作M2e（图1）[14]；而M2 蛋白C 端的54个氨基酸残基能与M1基质蛋白相互作用，影响病毒颗粒的装配和释放[14]。M2e 的氨基酸序列在人、禽和猪等甲型流感病毒中都很保守[1,15]。Liu 等分析比较了人、禽和猪流感病毒M2e短肽的氨基酸序列，发现人源与禽源流感病毒M2e 短肽有5 个氨基酸残基不同，而人源与猪源流感病毒M2e 短肽仅有2 个残基不同（图1）[16-17]。M2e 短肽N 端的8 个氨基酸残基（残基2～9：SLLTEVET）在不同亚型的甲型流感病毒中的同源性超过99%，而在人甲型流感病毒中的保守性可达100%[15]，因此针对人M2e 短肽的免疫血清能够识别禽M2e的序列[18]。

M2e 短肽可诱导产生针对多种亚型流感病毒的抗体，因此M2e 是研发流感通用疫苗的首选免疫原之一。M2e短肽与适当的载体分子结合或与流感灭活疫苗同时使用，可以减轻流感症状，提高免疫动物抵抗流感病毒攻击的能力，产生较好的交叉免疫保护[19]。动物试验和人体临床试验的初步结果都显示，M2e 流感通用疫苗安全、免疫原性好，且无明显的副作用[2,20]。

1.2 M2e通用疫苗的免疫保护机制

目前关于流感病毒HA 蛋白中和抗体的免疫保护机制已研究得比较清楚，针对HA 蛋白的血凝抑制抗体可以有效地中和游离的流感病毒及与细胞结合的病毒，有效预防流感发生。针对神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗体虽不具有直接中和流感病毒的作用，但它能够抑制NA 蛋白的活性，使得新生病毒粒子在细胞表面聚集，降低感染细胞的排毒量[21]。针对流感病毒NP和M蛋白的T细胞免疫能帮助清除流感病毒感染的细胞[22]。

M2e 诱导产生的确切保护机制仍不明了[23]。虽然针对M2e 短肽的抗体不能中和流感病毒，但它可提供交叉保护免疫并减轻流感症状[23-24]。M2e 短肽和载体分子结合或与佐剂联合使用，可以明显抑制不同亚型流感病毒在细胞内的复制，降低流感病毒在肺组织中的滴度和感染动物的排毒量，提高免疫动物的存活率，而且这种保护作用还可以通过其免疫血清被动转移给未经免疫的动物[8,25]。

目前普遍认为Fc 受体介导的巨噬细胞的吞噬作用、NK 细胞的直接杀伤作用、抗体依赖性细胞毒性、补体介导的细胞溶解等多种机制均可能与M2e通用疫苗的保护作用有关[1,18,26-28]。因此，进一步研究M2e 通用疫苗诱导免疫保护的机制，对弄清M2e 通用疫苗产生保护的途径，建立评估M2e 通用疫苗效力的检测方法，具有十分重要的意义。

2 M2e通用疫苗的特点及提高M2e通用疫苗免疫效果的方法

2.1 M2e通用疫苗的特点

尽管目前M2e 产生的免疫保护机制尚不清楚，但M2e 依然是一个颇具潜力的流感通用疫苗免疫原，理由主要如下：①M2e疫苗在动物实验中具有良好的保护效果；②M2e 的氨基酸序列在绝大多数甲型流感病毒株中高度保守，自1933 年分离出流感病毒以来M2e 的序列几乎未变，用其作为疫苗可避免常规流感疫苗只具有“毒株特异性免疫”的不足[15]；③M2e 疫苗可诱导产生交叉保护免疫反应，减少疫苗生产对流感病毒流行株预测结果的依赖，提前生产储备性疫苗预防突发性流感大流行；④M2e 大量存在于感染细胞的表面，容易被抗体识别[29]；⑤M2e的分子小，易于体外大量表达、纯化、制备；⑥M2e与适当的载体分子结合后，可大幅度提高其免疫原性及增强M2e疫苗的稳定性。

2.2 提高M2e通用疫苗免疫效果的方法

M2e 短肽的免疫原性不够强[30]，常需要加强免疫。为了克服这些不足，研究人员将不同的载体分子与M2e 短肽结合以增强M2e 短肽的免疫原性，提高M2e通用疫苗的免疫效果。目前常用的载体分子有乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）、人乳头状瘤病毒结构蛋白L1、钥孔血蓝素、脑膜炎奈瑟菌外膜复合体、脂质体及鞭毛蛋白等[2,4]。

2.2.1 M2e 四聚体通用疫苗 在流感病毒感染的细胞表面，M2 蛋白是以四聚体形式存在的，De Filette等发现针对M2 蛋白四聚体的抗体的保护效果明显优于针对其单体的抗体[31]。将酵母转录激活蛋白GCN4（general control nondepressible 4）四聚体与M2e 融合可形成M2e-GCN4 四聚融合体，明显提高M2e 短肽的免疫原性[31]。小鼠接种这种M2e-GCN4融合蛋白后，产生针对M2e的特异性抗体，即使小鼠在致死攻毒剂量情况下，100%被攻毒的小鼠均得到免疫保护而存活[31]。

2.2.2 M2e-病毒样颗粒疫苗 病毒样颗粒（viruslike particle，VLP）是指由病毒的结构蛋白自行装配而成的、不具感染性、不能复制的病毒蛋白颗粒。通过VLP 表达的蛋白能保持蛋白的天然构象及活性，并具有多价、免疫原性强等特点[17]。VLP 能使大量相同的外源免疫原（例如M2e）在VLP 表面有序排列，从而大幅提高外源蛋白的免疫原性和稳定性，因此通过表达M2e-VLP 可提高M2e 的免疫原性。由于没有流感病毒HA及NA这2种主要表面蛋白的遮蔽，并且M2e 短肽能以天然膜蛋白的形式充分暴露于VLP 表面，使M2e 便于被抗体识别。M2e-VLP 与流感灭活疫苗合用可提高M2e 诱导的交叉保护效果，抵抗不同亚型的甲型流感病毒（H1N1、H3N2 及H5N1）的攻击，而且这种交叉保护作用可以经抗血清转移给未被免疫的动物[19,32]。通过将M2e 与HBc的N 端融合，可产生M2e-HBc 融合蛋白。这种疫苗的免疫原性强，可大大降低流感病毒感染后的发病率，并提高小鼠攻毒后的存活率[8]。

2.2.3 M2e 多表位通用疫苗与佐剂联合使用 含有多个M2e短肽的通用疫苗能诱导产生针对M2e的抗体[25]，若将人源、禽源及猪源的M2e 短肽通过VLP 的形式同时表达，诱导产生的交叉保护反应更强，免疫保护持续的时间也更长[33-34]。将M2e 与HA2、NP 或M1 蛋白中保守的抗原表位共同表达，亦可提高M2e通用疫苗交叉保护的效果[35-36]。M2e 多表位疫苗与佐剂联合也可提高M2e 通用疫苗的保护效果。将M2e-HBc 与黏膜佐剂CTA1-DD 联合使用，通过鼻腔内接种，可诱导更强的免疫应答，使免疫动物获得完全的保护[15,37]。目前用于流感通用疫苗研发的佐剂还包括革兰阴性菌外膜鞭毛蛋白、MF59、CpG 寡核苷酸及免疫刺激复合物（immune stimulating complex，ISCOM）[35]。ISCOM 的特点是可以诱导产生体液和细胞免疫反应，降低疫苗使用量，且免疫力持续时间长。

3 M2e通用疫苗的试验动物模型

M2e通用疫苗在小鼠、雪貂、猪和恒河猴中表现出了不同程度的保护效果[2,38]。小鼠不是流感病毒的天然宿主，本身对流感病毒不易感，若以小鼠为流感病毒的实验动物模型，则需要产生能适应于小鼠组织的流感病毒株[39]。猪是甲型流感病毒的天然中间宿主，可被多种亚型的人或禽流感病毒感染，以猪作为流感病毒感染的动物模型可能要优于小鼠模型。雪貂对人流感病毒株易感，产生的流感症状与人流感相似，是流感病毒感染常用的动物模型[40]。恒河猴与人在免疫系统方面更相近，采用恒河猴作为流感病毒的感染模型所得到的结果可能与人体实验结果更接近[20]。大动物模型是否比小动物模型能更客观地反映M2e 通用疫苗的实际保护效果，值得进一步深入研究。

4 结语

动物实验和人体临床试验都表明，M2e 流感通用疫苗安全，具有较好的免疫原性和交叉免疫保护效果，无明显的副作用，显示出其良好的发展前景。理想的M2e流感通用疫苗应能有效刺激产生体液和细胞免疫反应，抵御不同亚型流感病毒的感染[41]，并具有保护效果好、免疫力持久、适用于不同年龄段的易感人群等特点。

深入探索M2e 的免疫保护机制，找出能反映M2e 通用疫苗免疫保护作用的免疫学及生物学指标，有助于建立有效评估M2e 疫苗免疫效果的方法。M2e 流感通用疫苗的近期发展目标，应以能降低流感病人死亡率、减轻流感的临床症状、减少患者排毒量及控制病毒传播为主；同时应探索M2e 通用疫苗和佐剂配合使用及疫苗接种的最佳途径，进一步提高M2e疫苗的交叉免疫保护效果及免疫持续时间。而制备安全、高效和成本低的M2e通用疫苗，则是流感通用疫苗研发的最终目标之一。

[1]Kang S M,Song J M,Compans R W.Novel vaccines against influenza viruses[J].Virus Res,2011,162(1-2):31-38.

[2]Ebrahimi S M,Tebianian M.Influenza A viruses:why focusing on M2e-based universal vaccines[J].Virus Genes,2011,42(1):1-8.

[3]Subbarao K,Matsuoka Y.The prospects and challenges of universal vaccines for influenza[J].Trends Microbiol,2013,21(7):350-358.

[4]Lee Y T,Kim K H,Ko E J,et al.New vaccines against influenza virus[J].Clin Exp Vaccine Res,2014,3(1):12-28.

[5]Salk J E,Pearson H E,Brown P N,et al.Protective effect of vaccination against induced influenza B[J].J Clin Invest,1945,24(4):547-553.

[6]Krammer F,Palese P. Universal influenza virus vaccines:need for clinical trials[J].Nat Immunol,2014,15(1):3-5.

[7]谭伟,徐倩,谢芝勋.禽流感病毒研究概述[J].基因组学与应用生物学,2014,33(1):194-199.

[8]Neirynck S,Deroo T,Saelens X,et al.A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein[J].Nat Med,1999,5(10):1157-1163.

[9]Schotsaert M,De Filette M,Fiers W,et al.Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines:preclinical and clinical developments[J].Expert Rev Vaccines,2009,8(4):499-508.

[10]Lamb R A,Lai C J,Choppin P W.Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus:colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(7):4170-4174.

[11]Schnell J R,Chou J J.Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus[J].Nature,2008,451(7178):591-595.

[12]Stouffer A L,Acharya R,Salom D,et al.Structural basis for the function and inhibition of an influenza virus proton channel[J].Nature,2008,451(7178):596-599.

[13]Slepushkin V A,Katz J M,Black R A,et al.Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein[J].Vaccine,1995,13(15):1399-1402.

[14]Chen B J,Leser G P,Jackson D,et al.The influenza virus M2 protein cytoplasmic tail interacts with the M1 protein and influences virus assembly at the site of virus budding[J].J Virol,2008,82(20):10059-10070.

[15]Fiers W,De Filette M,Birkett A,et al.A "universal" human influenza A vaccine[J].Virus Res,2004,103(1-2):173-176.

[16]Liu W,Zou P,Ding J,et al.Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design[J].Microbes Infect,2005,7(2):171-177.

[17]Kang S M,Kim M C,Compans R W.Virus-like particles as universal influenza vaccines[J].Expert Rev Vaccines,2012,11(8):995-1007.

[18]Fiers W,De Filette M,El Bakkouri K,et al.M2e-based universal influenza A vaccine[J].Vaccine,2009,27(45):6280-6283.

[19]Song J M,Van Rooijen N,Bozja J,et al.Vaccination inducing broad and improved cross protection against multiple subtypes of influenza A virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(2):757-761.

[20]Gilbert S C.Advances in the development of universal influenza vaccines[J].Influenza Other Respir Viruses,2013,7(5):750-758.

[21]Rebmann T,Zelicoff A.Vaccination against influenza:role and limitations in pandemic intervention plans[J].Expert Rev Vaccines,2012,11(8):1009-1019.

[22]Epstein S L,Kong W P,Misplon J A,et al.Protection against multiple influenza A subtypes by vaccination with highly conserved nucleoprotein[J].Vaccine,2005,23(46-47):5404-5410.

[23]Epstein S L,Price G E.Cross-protective immunity to influenza A viruses[J].Expert Rev Vaccines,2010,9(11):1325-1341.

[24]Zebedee S L,Lamb R A.Influenza A virus M2 protein:monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions[J].J Virol,1988,62(8):2762-2772.

[25]De Filette M,Min Jou W,Birkett A,et al.Universal influenza A vaccine:optimization of M2-based constructs[J].Virology,2005,337(1):149-161.

[26]Jegerlehner A,Schmitz N,Storni T,et al.Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2:weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity[J].J Immunol,2004,172(9):5598-5605.

[27]El Bakkouri K,Descamps F,De Filette M,et al.Universal vaccine based on ectodomain of matrix protein 2 of influenza A:Fc receptors and alveolar macrophages mediate protection[J].J Immunol,2011,186(2):1022-1031.

[28]Huber V C,Lynch J M,Bucher D J,et al.Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections[J].J Immunol,2001,166(12):7381-7388.

[29]Lamb R A,Zebedee S L,Richardson C D.Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface[J].Cell,1985,40(3):627-633.

[30]Feng J,Zhang M,Mozdzanowska K,et al.Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain of matrix protein 2[J].Virol J,2006,3:102.

[31]De Filette M,Martens W,Roose K,et al.An influenza A vaccine based on tetrameric ectodomain of matrix protein 2[J].J Biol Chem,2008,283(17):11382-11387.

[32]Wang B Z,Gill H S,Kang S M,et al.Enhanced influenza virus-like particle vaccines containing the extracellular domain of matrix protein 2 and a Toll-like receptor ligand[J].Clin Vaccine Immunol,2012,19(8):1119-1125.

[33]Kim M C,Song J M,O E,et al.Virus-like particles containing multiple M2 extracellular domains confer improved crossprotection against various subtypes of influenza virus[J].Mol Ther,2013,21(2):485-492.

[34]Kim M C,Lee J S,Kwon Y M,et al.Multiple heterologous M2 extracellular domains presented on virus-like particles confer broader and stronger M2 immunity than live influenza A virus infection[J].Antiviral Res,2013,99(3):328-335.

[35]张立霞,周剑芳,舒跃龙,等.通用型流感疫苗的研究进展[J].病毒学报,2014,30(1):73-78.

[36]Rudolph W,Ben-Yedidia T.A universal influenza vaccine:where are we in the pursuit of this "Holy Grail"[J]? Hum Vaccin,2011,7(1):10-11.

[37]De Filette M,Ramne A,Birkett A,et al.The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combina-tion with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection[J].Vaccine,2006,24(5):544-551.

[38]Fan J,Liang X,Horton M S,et al.Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice,ferrets,and rhesus monkeys[J].Vaccine,2004,22(23-24):2993-3003.

[39]Bodewes R,Rimmelzwaan G F,Osterhaus A D.Animal models for the preclinical evaluation of candidate influenza vaccines[J].Expert Rev Vaccines,2010,9(1):59-72.

[40]Smith H,Sweet C.Lessons for human influenza from pathogenicity studies with ferrets[J].Rev Infect Dis,1998,10(1):56-75.

[41]Ben-Yedidia T,Arnon R.Epitope-based vaccine against influenza[J].Expert Rev Vaccines,2007,6(6):939-948.