α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

贠志敏，张雪，李素波，檀英霞，冷泠，季守平，高红伟，宫锋

军事医学科学院 野战输血研究所血液分子生物学研究室，北京 100850

人体移植器官严重短缺日益受到关注，而异种移植是解决人体移植器官短缺的有效方法之一，也是现代临床医学发展的重要热点问题。猪的器官在结构、大小和生理功能上与人体相近，并且猪易于繁殖，成熟周期短，一胎多子，所患疾病易于控制，在伦理学方面相对于灵长类动物更易接受，因此猪被认为是异种移植最理想的供体之一。

研究表明，α-Gal 抗原是异种移植的主要异种抗原之一，它表达于除人和旧大陆猴外的所有哺乳动物体内，只是在种类和个体间表达量上有差异[1]。人体内存在天然的抗α-Gal 抗体，将动物的细胞、组织和器官移植给人体，将出现超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）。这些天然抗体在数分钟或数小时之后与移植物抗原结合，导致血管内皮被补体成分溶解/破坏，使血管完整性被破坏，进而导致水肿和出血进入下层组织。此外，凝血通路被激活，导致纤维蛋白单体沉淀，微血栓形成，最终致移植物肿胀、色泽暗红、流血量少、变软、无弹性、器官功能衰竭。因此，异种移植首先须清除异种抗原。国外的相关研究表明，使用α-半乳糖苷酶能有效清除异种细胞、组织表面抗原末端的α-Gal 残基，降低HAR强度，延长移植物的存活时间[2-4]。

本实验室从原核生物脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis）中克隆并表达了一种新型α-半乳糖苷酶[5]，属CAZy GH110 家族。研究表明，该酶不仅可切除支链多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R），也可切除直链多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R）[5-6]。猪体细胞表面的α-Gal抗原是以α-Gal为末端的直链多糖结构[7]。我们检测率猪体细胞表面的α-Gal 抗原，并进行了新型α-半乳糖苷酶去除α-Gal抗原的初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

猪胚肾细胞系PK-15 和猪睾丸细胞系ST（培养条件均为高糖DMEM+5%胎牛血清）由野战输血研究所章金刚教授惠赠；猪成纤维细胞系11WP1（培养条件为高糖DMEM+15%胎牛血清）和五指山小型猪红细胞（pRBC）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所潘登科教授提供。FITC-IB4 凝集素为Sigma 公司产品；流式细胞仪为Cytomics FC 500 Beckman Coulter。

1.2 猪红细胞的酶解实验[6]

采集的五指山小型猪抗凝血于500 r/min 离心5 min，弃上层血浆，用酶解缓冲液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）分别按1∶1、1∶4 洗涤红细胞2 次；按红细胞压积为40%加入不同剂量的重组α-半乳糖苷酶，于26℃酶解反应箱内缓慢振荡孵育2 h，酶解清除红细胞α-Gal抗原；用PBS 按1∶4洗涤红细胞2 次，加入1/2 体积的MAP 液保存红细胞；取部分酶解前后的红细胞，分别用4%多聚甲醛固定备用。

1.3 猪体细胞的酶解实验

将培养的细胞用PBS 洗2 次，胰酶消化5 min，血清终止后500 r/min离心3 min，弃上清，将收集的细胞用酶解缓冲液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）洗涤2 次，分别加入不同剂量（表1）的重组α-半乳糖苷酶，酶解体系为300 μL，细胞数为1×106，于26℃酶解反应箱内缓慢振荡孵育2 h 后离心弃上清，用PBS 洗涤细胞2 次，用4%多聚甲醛固定备用。

1.4 FCAS 分析酶处理前后细胞表面α-Gal 抗原的含量

IB4是从植物中提取的一种凝集素，可特异地与以α-Gal 为末端的糖链结合，而异种抗原（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R 和Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R）是以α-Gal 为末端的糖链结构。用FITC-IB4 凝集素（25 μg/mL）标记固定的细胞，室温反应3 h，用PBS 洗涤2 次，用流式细胞仪检测红细胞的荧光强度，按下式计算α-Gal清除率：

2 结果

流式细胞术检测结果表明，pRBC、PK-15、ST、11WP1 细胞均表达α-Gal 抗原，但表达量明显不同，11WP1 的表达量最高，平均荧光强度为598，而pRBC 的最低，平均荧光强度只有33，因此各种细胞所需酶量不同（图1，表1）。用0.04 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，pRBC 表面的α-Gal 抗原清除率可达99.84%；用0.5 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，PK-15、ST、11WP1 细胞表面的α-Gal 抗原清除率可达90%以上，但仍没有被完全清除，可能是因为这几类细胞表面的α-Gal 抗原表达量较高，需要酶解更长的时间。

表1 α-半乳糖苷酶酶解细胞表面α-Gal抗原所需剂量

3 讨论

α-Gal 抗原是异种移植的主要异种抗原之一，表达于除人和旧大陆猴外的所有哺乳动物体内。本研究发现，脆弱杆菌来源的α-半乳糖苷酶酶解清除动物红细胞表面异种抗原α-Gal 的活性远高于咖啡豆来源的α-半乳糖苷酶。以酶解猪红细胞为例，咖啡豆α-半乳糖苷酶的使用剂量为2～3 mg/mL[8]，而脆弱杆菌来源的α-半乳糖苷酶的使用剂量仅为0.002 mg/mL，并且酶解环境也从偏酸性变为中性。因此，该新型α-半乳糖苷酶是在异种移植中清除α-Gal 抗原，降低移植引起的HAR的理想工具酶。

虽然酶解法能够去除主要异种抗原，但移植后存活的异种组织或异种器官仍能继续分泌α-Gal 抗原，因此这种方法更适于终末期细胞或代谢率较低的组织或器官，如红细胞、皮肤、关节、韧带等，已有这些组织异种移植的相关报道和专利[9-11]。本研究证实，我们获得的来源于脆弱杆菌的α-半乳糖苷酶可用于清除不同类型猪体细胞表面的α-Gal 抗原，提示该酶可用于克服异种移植的HAR，是研制异种皮肤、关节、韧带的关键物质。

图1 流式细胞术检测α-半乳糖苷酶处理前后的细胞

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[6]高红伟,张雪,李素波,等.新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面α-Gal抗原的研究[J].中国实验血液学杂志,2012,20(5):1231-1234.

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