北虫草小分子肽抗氧化和耐缺氧机制研究

仵强 ，黄竹青，刘芹，王立强，周青阳，王洪军，吴扬，孙艳

1.陕西杨凌天和生物科技有限公司，陕西 杨凌 712100；2.辽宁卫生技术职业学院，辽宁 沈阳 110101；3.沈阳军区联勤部 疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110034；4.吉林大学 第一临床医院，吉林 长春 130021；5.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016

北虫草小分子肽是由北虫草子实体蛋白质经酶水解后生成，具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基的功能，相对分子质量低于10 000 的小分子肽类。本课题组前期工作表明，北虫草含有17 种氨基酸[1]，其中多种氨基酸如半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和缬氨酸、5-羟色氨酸及其衍生物具有抗氧化能力。氧化反应在人体代谢过程中产生自由基和活性氧基团，这些基团过多会对机体产生致死性损伤，特别是自由基可与活细胞中的糖、氨基酸、磷脂、核酸等发生反应而造成机体中毒。为进一步研究北虫草小分子肽抗氧化活性机制，开发北虫草小分子肽的实用价值，我们利用化学模型和动物模型探讨了北虫草小分子肽的抗氧化和心肌耐缺氧机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，体重（200±25）g，购自沈阳药科大学实验动物部（动物合格证号：辽实动字号第033 号），在实验室分笼饲养，实验室温度（16±2）℃，颗粒饲料，自动进食饮水，适应1 周后进行实验。北虫草小分子肽（5.78 mg/mL）以人工培养北虫草子实体为原料，经粉碎、蛋白提取、加热酶解、灭酶、抽滤、超滤和灭菌制备获得，为相对分子质量低于10 000 的混合物。木瓜蛋白酶购于广州裕立宝生物科技公司；碱性蛋白酶购于Novozymes 公司；PTN6.0 购于杭州三叶生物化工厂；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、谷胱甘肽（GSH，色谱纯）和Ferrozine铁试剂（分析纯）购自Sigma 公司；邻二氮菲、二苯代苦味肼、邻苯三酚、氢氧化钠、双氧水、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等试剂均为分析纯，购自国内试剂公司。WFZ UV-2000 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯公司）；KND-2C型定氮仪（上海纤检仪器有限公司）；PHS-25 数显pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；101A-2 型数显电热鼓风干燥箱（上海浦东跃欣科学仪器厂）；GL-21M 高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 小分子肽清除羟基自由基（·OH-）能力测定[2]

采用邻二氮菲法，以去离子水配制浓度分别1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的小分子肽溶液与还原型GSH对照液。

样品管：取1.5 mL 邻二氮菲溶液（5 mmol/L）加入2 mL磷酸盐缓冲液（pH7.4）混匀，加入2 mL样品溶液及0.5 mL EDTA（15 mmol/L），混匀，加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），用去离子水补至9 mL，充分混匀后加入1 mL H2O2（0.1%），摇匀，置37℃保温1 h，以D536nm值变化反映羟基自由基的氧化作用。损伤管：以去离子水代替样品，其余步骤同样品管。未损伤管：以去离子水代替H2O2，同损伤管。以还原型GSH为对照，计算·OH-清除率。

1.3 小分子肽清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH-·）测定[3]

取0.00 395 g DPPH，用95%乙醇溶解定容至100 mL，配置成0.1 mmol/L 的DPPH 溶液。小分子肽溶液与还原型GSH 对照液同1.2。取各样品液和对照液2.0 mL 与2.0 mL DPPH 溶液混匀，置室温30 min，测定D517nm值，以95%乙醇为空白对照，取3次测定的平均值，计算DPPH-·清除率。

1.4 小分子肽清除超氧阴离子自由基（）测定[4]

将邻苯三酚溶于10 mmol/L HCl，配置成3 mmol/L 的溶液，小分子肽溶液与还原型GSH 对照液同1.2。取100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5 mL，25℃水浴20 min 后立即加样品2 mL、蒸馏水3 mL、邻苯三酚0.5 mL（25℃保温），迅速混匀，恒温下每隔30 s测一次D325nm值，反应4.5 min 结束，样品抑制邻苯三酚自氧化速率为V样；空白管以10 mmol/L HCl 代替邻苯三酚溶液，反应启动后4.5 min 内邻苯三酚自氧化速率为V自，按下式计算清除率：

1.5 小分子肽提高心肌耐缺氧能力测定

[5]并有改动。大鼠48只随机分为4组，即对照组、实验组（包括3、10、30 mg/kg 组）。实验组按1.0 mL/20 g体重每天灌胃，对照组给予同体积的蒸馏水，持续4周，末次给药后1 h麻醉动物，切开颈部皮肤，分离气管，四肢连接心电监护仪，观察心肌活动情况，然后用动脉夹夹住气管，并按动秒表计时，直至心脏停止跳动，记录心肌耐缺氧时间。

1.6 数据的统计学处理

采用SPSS 10.0 统计分析软件，结果以表示，组间的两两比较采用单因素方差分析，组间P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 小分子肽清除·OH-的能力

结果见图1，小分子肽和GSH 浓度为1～3 mg/mL 时，二者清除·OH-的能力随浓度增加而升高，小分子肽组明显高于GSH 对照组［（87.6±1.72）%和（70.4±0.94）%，P＜0.05］；当浓度为4～5 mg/mL 时，对·OH-的清除能力趋于平缓，两者无显著性差异［（89.7±1.63）%和（88.9±1.41）%，P＞0.05］。

图1 小分子肽清除·OH-能力测定

2.2 小分子肽清除DPPH-·的能力

结果见图2，随小分子肽和GSH 浓度的增加，两者清除DPPH-·的能力也提高，小分子肽组明显高于GSH 对照组［（77.7±0.17）%和（55.7±0.29）%，P＜0.05］；当浓度为3 mg/mL 时，两者对DPPH-·的清除率达80%以上，但浓度继续增加时其清除力趋于平台期，对DPPH-·的清除能力基本接近［（90.1±0.14）%和（86.9±1.06）%，P＞0.05］。

2.4 心肌耐缺氧能力测定

结果见表1，北虫草小分子肽对小鼠有抗心肌缺氧的作用，与对照组比较差异显著（P＜0.01），呈剂量-效应关系，随着剂量的增加，作用加强。

图2 小分子肽清除DPPH-·能力测定

图3 小分子肽清除·能力测定

表1 北虫草小分子肽对小鼠心肌耐缺氧的影响（n=12，）

表1 北虫草小分子肽对小鼠心肌耐缺氧的影响（n=12，）

*与对照组比较，P＜0.01

3 讨论

1956年英国学者Harman就提出了自由基学说，认为自由基具有高度的化学反应活性，是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，能够攻击生物大分子，造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。正常情况下，人体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡中，但自由基产生过多或清除过慢时，它通过攻击生物大分子物质及各种细胞器，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病[6-7]。本实验结果表明，北虫草小分子肽对·OH-和DPPH-·的清除能力在一定的剂量范围内与浓度呈正相关，达到一定剂量时出现平台期，并与GSH的清除能力相同。在·的清除能力方面，小分子肽弱于GSH。在此基础上的动物体内试验结果表明，北虫草小分子肽对大鼠具有耐心肌缺氧的作用，呈剂量-效应关系。分析探讨其机理，氨基酸种类、序列和构型可能是决定其抗氧化活性的物质基础。我们用高效液相色谱测定，北虫草含有丰富的亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸等[8]，其中谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量接近亮氨酸、酪氨酸的2 倍。这些氨基酸残基是组成抗氧化肽的必要成分，它们通过将氢原子提供给自由基，形成吲哚自由基和苯氧自由基，借助共振而稳定，达到自由基链式反应减慢或终止的目的[9]。芳香族氨基酸可通过供氢发挥抗氧化作用。如酪氨酸是典型的供氢体，苯环为共轭体系，使其酚羟基上电子氧电子云密度增大，其共轭体系受侧链上的基团影响，尤其是酪氨酸对位的甲基，其诱导效应进一步使酚羟基氧的密度增大，并且使其脱掉质子后形成的自由基中间体更趋于稳定，所以认为抗氧化肽的高生物活性在于肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的作用，增加了作为自由基中间体的稳定性。据报道，有抗氧化作用的肽具有通过清除自由基，增加Ca2+-Mg2+-ATP 酶（Ca2+泵）和Ca+-K+-ATP 酶（Na+泵）活性的作用，间接实现心肌细胞耐缺氧，延缓心肌衰老[10]。

综上，北虫草小分子肽是食品、保健品和化妆品领域具有产业化价值的生物活性肽。

参考文献

[1]王立强,王洪军,吴益民,等.北虫草粉中有效成分的分析[J].沈阳部队医药,2010,23(3):152-153.

[2]金鸣,蔡亚欣,李金荣.邻二氮菲—Fe2+氧化法检测产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(6):553-555.

[3]Wu H C,Chen H M,Shiau C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel[J].Food Res Int,2003,36(9-10):949-957.

[4]Chen Y F,Lin M,Huang K F.Antioxidant activity of jacaranda acutifolia flower[J].J Chin Med,2006,17(4):143-150.

[5]方志伟,孙建平,陈实.西洋参蜂王浆对小鼠耐缺氧和耐寒作用的研究[J].中医药学报,1999,(01):58.

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[7]Li Y W,Li B,He J G,et al.Structure-activity relationship study of antioxidative peptides by QSAR modeling:the amino acid next to C-terminus affects the activity[J].J Peptide Sci,2011,17(6):454-462.

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[9]朱蕴菡,刘睿,吴皓,等.活性肽构效关系的研究进展[J].中华中医药杂志,2012,27(10):2625-2628.

[10]李琳,赵谋明,吴敏芝,等.鳙鱼抗氧化肽延缓衰老的研究[J].中国食品学报,2007,7(1):43-47.