TBK1 通过增强雌激素受体α的转录活性参与乳腺癌发生的分子机制

郝钦芳，邹德勇，张丽萍，张小丽，葛晓幸，杨晓莉

武警总医院 检验科，北京 100039

IKK 相关激酶是最近发现的功能和IKK（inhibitor of NF-κB kinase）相近的激酶，包括TANK 结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和IKKi（又称为IKKε），均为丝氨酸激酶[1]。TBK1包含729个氨基酸残基，其N 端1～290 位有一个激酶结构域，在激酶结构域之后的299～383 位之间存在一个泛素样结构域（ubiquitin-like domain，ULD），此外在603～650位及679～712 位包含2 个螺旋-环-螺旋（helix-loophelix，HLH）结构域。激酶结构域是TBK1 发挥其丝氨酸磷酸化的重要结构域，而ULD 则与其激酶活性、与底物结合相关[2]。TBK1 几乎在所有组织中稳定表达，Northern 印迹分析表明，TBK1 在胃、小肠、肺、皮肤、脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺等器官中广泛表达[3]。

雌激素受体（estrogen receptors，ER）包括ERα和ERβ，它们都属于核受体超家族[4]。ER 能够激活含有雌激素应答元件（estrogen responsive element，ERE）基因的转录，从而引起细胞的恶性转化[5]。ERα在乳腺癌的发生发展过程中起关键作用。研究表明，ERα的磷酸化可以影响其转录激活活性[6]。ERα磷酸化可影响ERα与DNA 和配体的结合能力以及ERα的稳定性，进而影响其转录激活功能活性。ERα的Tyr537的磷酸化可调节ERα的二聚体化和DNA 结合能力，Ser118磷酸化可调节ERα的转录激活功能。用定向性位点突变试验检测ERα磷酸化后的活性，发现Ser118突变为Ala 后ERα的活性降低约25%，但与Ser104、Ser106同时突变时ERα活性可降低50%[7]。总之,这些研究表明ERα的磷酸化影响其转录激活活性。

因为TBK1 具有激酶活性，而ERα又受磷酸化调控，我们推测TBK1 可能参与调控ERα。在本研究中，我们在细胞体系中过表达TBK1，发现其可以增强ERα的转录活性，而这与TBK1 在先天免疫途径中的功能无关，而且TBK1 可以通过磷酸化ERα Ser305位调控其下游相关基因的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T、MCF-7 细胞购自中国科学院上海细胞库；大肠杆菌DH5α感受态菌株购自北京天根生化科技有限公司；Flag-ERα及其突变体、HA-ERα以及ERE-Luc 由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓研究员惠赠；Flag-TBK1 和HA-TBK1 及其突变体由本室构建；抗Tubulin、抗Flag 购自Sigma 公司；HRP标记的羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗购自中杉金桥生物科技公司。

1.2 转染质粒的制备

将新鲜的质粒转化菌液接种至5～8 mL 含有抗生素的LB 培养基中，37℃、200 r/min 过夜培养16～18 h，用天根公司的普通小提质粒试剂盒提取质粒，用分光光度计测定质粒的D260nm和D280nm值，计算质粒浓度，并依据D260nm/D280nm比值判断所提质粒的纯度。

1.3 细胞培养、传代和转染

细胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，在含5% CO2的恒温孵育箱中培养，采用胰酶消化法传代。传代时先吸去培养基，加入PBS清洗细胞；加入1 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使胰酶消化液覆盖细胞表面，室温放置3～5 min（根据不同细胞）；之后加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打细胞并形成细胞悬液；将细胞加入15 mL 离心管中，1000 r/min 离心至管底，用新鲜DMEM 培养基重悬细胞，并加入新的细胞培养皿中继续培养。冻存细胞株时，先用胰蛋白酶消化细胞，同上将细胞离心至15 mL 离心管底部，用含10%二甲基亚砜（DMSO）、20%胎牛血清、70% DMEM 培养基的冻存液重悬细胞，之后将含有细胞的冻存液分装至细胞冻存管中，做好标记，先置于-70℃过夜，次日取出并投入液氮罐中保存。

利用转染试剂进行细胞转染。6 cm 培养皿中细胞生长至60%～80%汇合度时进行转染。转染前1 h 更换2 mL 新鲜的DMEM 培养基，将1 μg 质粒和2 μL 脂质体分别用生理盐水稀释，混匀后静置5 min，将含有脂质体的稀释液逐滴加至含有质粒的稀释液中，混合后室温放置15～20 min，使质粒与脂质体形成复合物，之后加入细胞中，轻轻晃动培养皿使之混匀，继续培养4～6 h 后更换新鲜培养基，24～48 h后收集细胞。

1.4 萤光素酶报告基因检测

用12孔细胞培养板培养细胞，转染24 h后将待测细胞中的培养基吸去，每孔加入1 mL PBS 漂洗细胞，之后每孔加入100 μL 1×裂解缓冲液（Promega公司），将12孔板置于摇床中，室温裂解10 min后12 000 r/min 离心1 min，将上清转移至新管中；将40 μL 细胞裂解液加入新试管中，之后在管中加入50 μL 萤光素酶检测试剂（LAR），混匀后用萤光光度检测仪检测发光值（如果所测得数值不在量程之内，则须调节萤光光度计的灵敏度），然后加入50 μL 反应终止液，并测定海肾萤光素酶的发光值作为内参，两者的比值即为萤光素酶的活性。

1.5 免疫印迹实验

将收集的细胞在4℃预冷的离心机中2000 r/min 离心5 min，弃尽上清；用1 mL 预冷的1×PBS 洗涤细胞2 次，吸尽PBS；加入凝胶上样缓冲液，100℃沸水浴5 min，离心后进行SDS-PAGE，电压为80～120 V，具体操作参照《分子克隆实验指南》（第3版）。

将PVDF 膜在甲醇中浸泡30 s，之后与2 张2.5 mm厚的滤纸在半干转移缓冲液中浸泡；将电泳结束后的SDS-PAGE 胶浸入半干转移缓冲液中，自下而上按照滤纸-胶-膜-滤纸的顺序放置在半干转移仪（Bio-Rad 公司）的2 块电极之间，尽量赶尽胶和PVDF 膜之间的气泡；设置转移电压18 V，转移时间1.5 h；转移结束后将PVDF 膜放入含5%脱脂奶粉的1×TBST 缓冲液中封闭1 h，之后用含1×TBST 或含5%脱脂奶粉的1×TBST，或者直接用1×PBST 配制的抗体（一抗）室温孵育PVDF膜1 h或过夜孵育，结束后用TBST 洗3次，每次5～10 min；一抗孵育结束后，按需加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体（二抗），室温孵育1 h，用同上方法洗膜；每种抗体孵育结束后回收抗体，进行化学发光，用X线胶片曝光。

1.6 细胞总RNA的提取及RT-PCR

由于RNase极易造成污染，故首先应当用DEPC浸泡处理所有容器以去除RNase。各种枪头和EP管均使用无RNase产品（Axygen公司）。

用10 cm 细胞培养皿培养细胞，待细胞铺满后提取总RNA。首先吸去培养基，用PBS清洗细胞，加入1 mL TRIzol 试剂（Invitrogen 公司）处理细胞，将所有液体转移至新的EP 管中，14 000 r/min 离心10 min，将上清转移至新的EP 管中合并，加入0.2 mL 氯仿，剧烈振荡15 s 后静置3 min，在预冷的离心机中离心15 min，小心吸取上层水相至新的EP管中，在收集的液体中加入0.5 mL 异丙醇，-20℃低温冰箱中放置10 min（可在冰箱中长期保存）使RNA析出，离心10 min，小心倒去上清，用DEPC 水配制的75%乙醇洗涤，14 000 r/min离心5 min后弃尽上清，在无RNase 的通风橱中干燥，但不能吹得太干，将白色沉淀物在100 μL DEPC 处理过的水中溶解，用分光光度计测量D260nm值，并计算RNA 含量，之后进行琼脂糖凝胶电泳，观察5S、18S、28S 核糖体rRNA条带，用于判断提取的RNA的质量。

之后进行反转录反应，反应体系包括总RNA 1 μg、oligo（dT）（50 μmol/L）1 μL、RNase 抑制剂1 μL、反转录缓冲液5 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、反转录酶（M-MLV）0.5 μL，加DEPC 水至25 μL。在PCR 仪中进行RT-PCR 反应，反应程序设置为42℃1 h、95℃5 min。反转录得到的cDNA 可用于后续特异性PCR反应。

PCR反应体系包括cDNA模板5 μL，10×PCR 反应缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTP 混合物1 μL，上、下游引物各1 μL，普通高效Taq酶（TaKaRa 公司）1 μL，加入去离子水补至50 μL。在PCR 仪上设置反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 kb/min，循环次数根据不同基因的丰度调整，一般为14～22个循环；最后72℃延伸5 min。利用β-actin引物扩增β-actin，作为内参。qPCR引物见表1。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 TBK1可以增强ERα的转录活性

为了研究TBK1 是否能调控ERα的转录活性，我们在HEK293T 细胞中瞬时转染HA-ERα/Flag-TBK1 和ERE-Luc 报告基因（ERα转录结合元件，此报告基因的激活表示ERα入核启动转录）及pRL 质粒，选用HA-Vector（vector）/Flag-Vector（Ctrl）作为对照，检测TBK1 对ERα转录活性的影响。实验结果表明，与阳性对照组Flag-Vector（Ctrl）和HA-ERα相比，共转Flag-TBK1 和HA-ERα能够更为显著地增强ERE 的转录活性；而作为阴性对照，共转HAVector（vector）和Flag-Vector（Ctrl）或共转HA-Vector（vector）和Flag-TBK1 时则几乎不能增强ERELuc报告基因的转录活性（图1A）。为了检测这种转录活性增强作用是否具有特异性，是否与雌激素的刺激有关，我们又选择了能表达内源ERα的乳腺癌细胞系MCF-7，并在体系中加入雌激素（E2）刺激，瞬时转染Flag-TBK1，选用Flag-Vector（vector）作为对照。实验结果显示，在MCF-7 细胞中无论是否加入E2，TBK1都可以增强ERα的转录活性，而加入E2后TBK1的激活作用显著增强（图1B），说明TBK1对于ERα转录活性的增强具有特异性，既是雌激素依赖的，又是雌激素非依赖的。

表1 引物及序列

2.2 TBK1 增强ERα转录活性的功能不依赖于其激活先天免疫途径的功能

为了研究TBK1 增强ERα转录活性的功能是否与其激活先天免疫途径的功能相关，我们首先将Flag-TBK1 或Flag-TBK1（L352A，I353A）突变体（此突变体为实验室保存，依照文献报道，会丧失激活先天免疫途径的功能）分别与IFN-β-Luc、IRF3-Luc、NF-κB-Luc 报告基因及pRL 质粒共转染HEK293T细胞，同时转染Flag-Vector（vector）作为阴性对照，24 h后收集细胞检测荧光素酶活性，并通过Western印迹检测相关蛋白的表达。结果显示，野生型TBK1能明显激活IFN-β、IRF3 和NF-κB，而Flag-Vector（vector）阴性对照和Flag-TBK1（L352A，I353A）突变体几乎不能激活IFN-β和NF-κB 信号传导通路（图2），说明TBK1 的这2 个位点突变后使其丧失了激活先天免疫途径的功能。

图1 TBK1增强ERα的转录活性

接着，我们在MCF-7 细胞中瞬时转染Flag-TBK1/Flag-TBK1（L352A，I353A）和ERE-Luc 报告基因及pRL质粒，检测TBK1及其先天免疫途径功能缺失突变体对ERα转录活性的影响，并用Western印迹检测各蛋白的表达水平。结果显示，TBK1（L352A，I353A）与野生型TBK1 一样，都可以明显增强ERα的转录活性（图3），说明TBK1 对ERα转录活性的激活不依赖于其激活先天免疫途径的功能。加入TBK1 的抑制剂BX795 后，TBK1 对ERα的激活作用受到明显抑制证明了TBK1 对ERα的转录激活作用。为了探讨TBK1 的激酶活性对其激活ERα转录活性的功能是否有影响，我们转入Flag-TBK1（K38A）质粒（激酶活性缺失突变体），检测其对ERα的转录活性是否具有激活作用，发现其对报告基因的激活作用降至野生组的1/2 水平（图3），说明TBK1 的激酶活性对其激活ERα转录活性的功能具有重要作用。

图2 TBK1（L352A，I353A）不能激活先天免疫途径

2.3 TBK1通过磷酸化修饰ERα的S305位增强其下游基因的表达

为了进一步证明TBK1 对ERα转录活性的激活作用，寻找可能的作用机制，我们将TBK1 与ERα/ERα（S305A）突变体（磷酸化位点突变）共转HEK293T 细胞，用RT-PCR 实验检测ERα下游基因的表达。结果表明，在野生型ERα存在时，TBK1 能够明显增强ERα下游基因的表达；在ERα（S305A）突变体存在时，TBK1却不能增强ERα下游基因的表达（图4）。野生型ERα下游基因的表达比磷酸化位点突变的ERα（S305A）下游基因的表达水平高（野生型ERα组的cyclin D1表达水平是突变体组的近3倍，Bcl-xL的表达水平是突变体组的近2倍，C3的表达水平是突变体组的近5 倍，c-fos的表达水平是突变体组的3 倍多，c-Myc的表达水平是突变体组的4倍，pS2的表达水平是突变体组的3 倍多，catD的表达水平是突变体组的近4 倍），不但证明了TBK1 对ERα转录活性的增强作用，而且证明这种作用是依赖于TBK1对其S305位的磷酸化修饰实现的。

图3 TBK1（L352A，I353A）能够激活ERα的转录活性

图4 TBK1通过磷酸化修饰ERα S305位增强其下游基因的表达

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，雌激素在乳腺癌的发生发展中有极其重要的作用。转录因子ERα通过与雌激素结合，调控含ERE 基因的表达，因此，ERα在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用。本研究的主要发现包括：TBK1可以增强ERα的转录活性；将TBK1 进行L352A、I353A 位点突变后，其丧失激活先天免疫途径功能，但仍然能够增强ERα的转录活性，说明此作用不依赖于其在先天免疫途径中的功能；TBK1 可以通过磷酸化ERα的S305 位激活ERα，使其入核启动下游基因的转录。这些发现进一步阐明了乳腺癌发生的机制，对乳腺癌的治疗和靶向药物开发具有一定的指导意义。

TBK1中有一个重要的泛素样结构域，研究发现ULD 对于TBK1 的磷酸化活性以及其和下游磷酸化底物的结合有着重要的作用[1]。当TBK1 的ULD 被突变之后，TBK1 就失去了与下游激酶底物IRF3 及IκBα结合的能力，从而失去激活下游Ⅰ型干扰素分泌及NF-κB 信号通路的功能。我们将ULD 中重要的352 位Leu 和353 位Ile 都突变为Ala，发现突变体组相比野生型TBK1组几乎不能激活IFNβ及NF-κB信号传导通路，但依然能够激活ERα的转录活性，这就表明TBK1 参与ERα信号通路并不依赖于其对NF-κB 通路及IFN-β通路的激活，这些研究初步阐明了先天性免疫信号通路和乳腺癌发生之间的关系。

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