微囊藻毒素-LR超灵敏均相免疫分析方法的建立与优化

张 艺，黄 飚，钮伟民，赵灿培，金 坚

(1.江南大学药学院药物设计与分子药理室，江苏无锡 214122;2.江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，江苏无锡 241063;3.无锡市疾病预防控制中心检验部，江苏无锡 214023)

微囊藻毒素(microcystin，MC)是在蓝藻水华污染中出现的最广泛、毒性最大的一类毒素，由7个氨基酸组成，并且有多种异构体形式，其中含量高、毒性大、研究最深入、报道最多的异构体是MC-LR，它对人体有很强的肝毒性，影响机体免疫功能，明显抑制吞噬细胞、T细胞和B细胞功能和肿瘤坏死因子α的基因转录与表达，严重时可诱发肝癌［1－2］。然而，随着淡水水体的富营养化加剧，各地蓝藻水华时有爆发［3］。因此，1998年世界卫生组织制定了饮用水中 MC-LR 含量低于 1.0 μg·L－1的指导标准;我国也于2006年制定了相应的标准《生活饮用水卫生标准》［4－5］。为了更好地监测水体中藻毒素的含量，许多检测技术已经投入应用。目前，检测方法主要有物理化学法(如:高效液相色谱法、液质联用分析法)、生物化学方法(常见的有蛋白磷酸酶分析法)、分子生物学方法(PCR法)以及免疫分析法(放免、酶免、时间分辨荧光免疫分析法等)［7－13］。免疫检测技术，基于抗原抗体之间的特异性反应，相对简便、快速，适用于定量检测，因仪器价格合理，操作方便，近年来广受关注，使用率也越来越高。鉴于此，建立一种快捷灵敏的免疫检测MC-LR的方法，先将毒素含量超标的水体采样筛选出来，再采用精确繁复的物理仪器确定，将利于对水环境实施快速监测，对人民健康具有积极作用。本研究基于光激化学发光均相免疫检测方法(AlphaLISA)，利用抗体-抗原间的特异性反应，实现高灵敏和快速检测样本中MC-LR的含量。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

MC-LR、氰基硼氢化钠、2-(N-)吗啉-乙磺酸(2-［N-morpholino］ethanesulfonic acid，MES)和羧甲氧基半盐酸盐(carboxymethlamine hemihydrochloride，CMO)，美国 Sigma-Aldrich公司;MC-LR-BSA、MC-RR、MC-LR和抗MC-LR多克隆抗体，无锡市疾病预防控制中心提供;生物素-羊抗兔IgG抗体，华美生物工程公司;AlphaLISA发光球和包被链霉亲和素的感光微球，美国PE公司;其他试剂均为国药分析纯。AlphaLISA免疫检测仪(Lica HT)，由上海博阳生物科技公司生产。

1.2 MC-LR－BSA发光微球的制备

首先将1 mg发光微球、0.05 mg MC-LR-BSA和 12.5 μL 的 1% 吐温-20 溶液，以及 10 μL 的25 g·L－1的氰基硼氢化钠混合在离心管中，然后用0.01 mol·L－1的 MES 溶液(pH 6.0)补充至200 μL体积，令上述溶液充分混合后37℃反应过夜。次日，加入10 μL CMO 0.3 mol·L－1(pH 5.0)终止连接反应，37℃孵育1 h。之后，连有MC-LR-BSA的发光微球离心浓缩，再超声混匀以提纯，重复上述步骤2次。最后，将微球溶于含有0.1%Proclin-300的 PBS(pH 7.4)，2 ～8℃保存。

1.3 标准品工作液的制备

将MC-LR原液溶于甲醇，再用PBS(pH 7.4)稀释至0.1，0.2，0.5，1.0 和 5.0 μg·L－1，0 浓度点即为对应的PBS溶液。

1.4 抗体稀释度的选择

将一抗分别稀释1∶100到1∶8000，测定对应的零浓度点结合率(Bound 0，B0)，再通过稀释度曲线，选取斜率最大即ED50时的稀释度，获得本研究最佳一抗稀释比。

在一抗浓度选取的基础上，再调整二抗生物素-羊抗兔的稀释倍数，测定其从1∶100至1∶10 000时 B0和非特异性结合(non-specific bounding，NSB)的荧光值，以获得高结合率和较低的NSB。

1.5 反应缓冲液的选择

分别制备 pH 7.4 PBS 0.05 mol·L－1、Tris-HCl和 HEPES 缓冲液，均加入 0.2%BSA、0.1%吐温-20，2～8℃保存备用。在AlphaLISA反应时用上述溶液稀释试剂，按照反应步骤操作，分别测定标准品工作液。根据各浓度点荧光值，确定最佳反应缓冲液。

1.6 样品的制备

因 MC 在0 ～200 μg·L－1时溶于水［6］，澄清水样可直接检测;若样本混浊，则取2 mL混匀水样置于离心管中，3188×g离心20 min，转移上清待测。

样本中MC-LR的提取:含藻水样的MC-LR存在于胞外和胞内，通过20 MHz超声波间歇振荡2 h，破碎藻细胞，释放胞内MC;再按照上述步骤离心取澄清部分，获得总MC-LR。

所有水样均由无锡市疾控中心提供，取自太湖沿岸水厂。

1.7 检测步骤

取包被有MC-LR的发光微粒、标准品或处理好的样品、一定浓度的抗MC-LR抗体和生物素化二抗共4种试剂各20 μL加至白色不透明微孔板，37℃孵育;加入包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育。在Lica HT检测仪上检测光信号，从标准曲线测算出样品中的MC-LR含量。

1.8 统计学分析

实验数据用Origin8.0软件进行处理，显著性分析采用t检验，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 抗体工作浓度的选择

结合仪器荧光计数效率，兼顾计数误差，分析抗体稀释度曲线的二次导函数为0的最大和最小值之间的斜率最大部分，定位ED50为最适抗体工作浓度，结果见图1。即抗体稀释度为1∶1000时，以此作为本研究合适的工作浓度。

Fig.1 Dilution curve of polyclonal antibody by microcystin(MC)-LR AlphaLISA.Series diluted polyclonal antibodies were added to wells with blank sample by MC-LR AlphaLISA.Each dilution was tested twice.B100:bound 100;standing for counts per second(cps)of zero concentration，when dilution rate was 1∶100.n=2.

2.2 二抗反应浓度的确定

在兔多抗浓度为1∶1000时，对生物素－羊抗兔的浓度进行了选择，并比较了对应的NSB的干扰荧光值，结果见图2。当二抗浓度在1∶200时，有最高的荧光值(B0最大)和相对较低的NSB，即最佳信噪比B0/NSB。因此，选择此浓度为生物素二抗反应浓度。

2.3 反应体系的选择

为考察反应缓冲液对本研究反应体系的影响，分别采用HEPES，PBS和Tris-HCl稀释各试剂进行检测，结果见图3。当采用PBS和Tris-HCl缓冲液时，对竞争反应的影响差异不大;而用HEPES时，发光效率较低。因PBS缓冲体系在免疫反应中较为常用，所以本研究选用PBS缓冲液。

Fig.2 Bound 0(B0)/non-specific bounding(NSB)change in different dilutions of biotinylated second antibody.Biotinylated second antibody was diluted from 1∶100 －1∶10 000 to get higher bounding with lower NSB in competitive MC-LR system.n=2.

Fig.3 Standard curves of MC-LR with HEPES，PBS and Tris-HCl buffer by AlphaLISA.MC-LR AlphaLISA was optimized in different reaction buffer，which was HEPES，PBS and Tris-HCl，respectively.

2.4 反应时间的优化

免疫反应的时间对于抗原抗体的结合速度影响较大，一般随着时间的延长，结合率会升高，相应零浓度点的荧光值越高。而获得又快又准的荧光计数也是方法建立时的目标，由图4可知，在37℃反应，MC-LR AlphaLISA第一步时间延长结合率更高，30 min后结合率升高不明显(图4A);第二步反应速度相当较快，10 min后达到稳定(图4B)。因此，选用第一步反应30 min，第二步10 min作为本方法的反应时间。

2.5 MC-LR的AlphaLISA均相免疫分析法

经2.1～2.4反应条件的优化，得到竞争法MC-LR AlphaLISA的对数拟合标准曲线和精确性分析如图5所示。

2.6 方法学考核

2.6.1 灵敏度和稳定性

Fig.4 Effect of different time on first reaction(A)and second reaction(B).At 37℃，B0of different reaction times，5－40 min，was compared by MC-LR AlphaLISA method in the first step and second step.n=2.

Fig.5 Standard curves and coefficient variation of MC-LR AlphaLISA.The best reaction condition confirmed in this research was that the dilution rate of poly antibody and biotinylated goat anti rabbit was 1∶1000 and 1∶200，respectively，PBS was used as the reaction buffer，the reaction time of first and second step was 30 min and 10 min，respectively.MC-LR standards were determinated twice under the condition mentioned above.n=2.

2.6.2 准确性与精密度

根据标准曲线的线性范围和有效剂量值，在每份空白样品中分别添加低中高浓度的MC-LR标准品，每份样品重复测定3次MC-LR含量，取平均，计算实测值与添加值之比，可得到样品的添加回收率，即竞争型MC-LR准确性。相同实验重复3次后，考核其变异系数，由此表征本方法的精密度。结果见表1。

Tab.1 Accuracy and precision of MC-LR AlphaLISA

2.6.3 健全性

取高浓度样本经离心得上清液，稀释2，5和20 倍后分别添加到 0.1 ～5.0 μg·L－15 个参考标准品中，按检测程序测定，各稀释浓度测定值分别做曲线与标准品曲线比较。图6显示，以3种稀释液为基质，测定结果呈线性，与标准曲线重合或平行，本研究建立的检测方法健全性良好。

Fig.6 Validity curves of MC-LR AlphaLISA.The validity was estimated by the comparison of calibration curves constructed both before and after dilution of a series of positive samples with high amounts of MC-LR.The dilution rate was 2-fold，5-fold，and 20-fold，respectively.STD:standard curve without spiked;S1，S2 and S3:spiked with 2-fold，5-fold，and 20-fold dilution of high concentration samples，respectively.n=2.

2.6.4 特异性

MC-RR和MC-RY是MC-LR的结构类似物，分别将其稀释至 5 μg·L－1后复孔检测 MC-LR AlphaLISA，交叉反应率分别为13.2%和0.91%。

2.7 水样检测

随机选取水样检测时，经离心取澄清检测，发现含蓝藻的水体仅1 例超出1.0 μg·L－1的国家标准，其余15例均符合国家标准。经过超声波破壁处理后，MC-LR释出，浑浊样本组的超标率增加至7例，产生了显著差异(P＜0.05)。而一般澄清水体超声前后，MC-LR含量变化不大 ，且没有超标样本出现。可见，与相关报道一致［15］，MC-LR的含量与蓝藻密度、藻体是否分解有关。

Tab.2 MC-LR detection of water samples

3 讨论

随着工业发展和农药滥用，很多污染物未经处理直接排放入江湖之中，造成水体蓝藻暴发事件时有发生［14－15］。

本实验采用的AlphaLISA被誉为免洗的ELISA方法，于2008年问世，有快速、稳定、高灵敏、无放射污染和操作简单的特点，技术核心是单线态氧的产生和传递，基于直径200 nm的微球实现，即本方法运用的发光微球和感光微球［16－17］。因此，该方法不同于传统的酶免、放免，避免了异相的洗涤过程，从而减少了操作误差，进而得到较好的精密度，本方法的CV＜10%。由于采用微粒技术，使得反应的比表面积增加，抗体抗原之间的免疫应答更易进行，小分子的MC-LR更容易被抗体所捕获，从而缩短了反应时间，提高了反应的灵敏度。与传统的免疫反应至少需要1 h，且不包括显色时间，相对地，AlphaLISA从第一步加样到完成检测本方法耗时40 min，较其他异相免疫方法节约时间。本方法上样量每孔 20 μL，灵敏度达到0.006 μg·L－1，较时间分辨荧光免疫分析法的每孔50 μL和灵敏度0.01 μg·L－1［13］相比，试剂消耗少，反应灵敏。

在水样检测部分，通过超声波破碎，将蓝藻胞内MC-LR释放，与未破膜的结果产生显著差异，说明:胞外藻毒素只是蓝藻在代谢中产生的一部分毒素，而大量的毒素在藻体死亡后仍可能释放溶出，造成环境污染，对人类造成健康威胁。

通过考察抗体的反应浓度、反应体系、反应时间，本文建立了一种MC-LR的高灵敏AlphaLISA均相检测方法，其检测范围0.006 ～5 μg·L－1，能够满足国家对于饮用水MC-LR的限量标准。其变异系数小于10%，回收率介于80～120%，平均回收率107.7%，表明方法稳定，准确。因本方法免疫反应时间＜1 h，是目前相对快速的免疫检测手段，上样量小，适于国内多水域以及水源水的大样本监测。

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