去氧胆酰酪氨酸对人类精子质膜完整性和细胞凋亡的影响

温成丽，职瑞娜，王玉柱，黄 超，李卫华，丁训城

(1.复旦大学公共卫生学院，上海 200032;2.上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室，上海 200032)

目前使用最广泛的阴道杀精剂壬苯醇醚-9，长期使用会导致阴道黏膜刺激症状并导致泌尿系统感染增加，因此新型高效、低毒兼具抗精子特异性活性的外用避孕化合物不断被发现，国内外正在对这些活性化合物进行抗精子靶标和机制的研究［1］。

胆酸及其衍生物去氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDC)是一类存在于人体胆汁中的天然的表面活性物质。Courtot等［2］证实，它们具有杀灭精子作用，而且能抑制人免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的复制，这类胆酸衍生物的细胞毒性较低，对人的肠黏膜细胞没有任何损害作用。为进一步提高药效，降低副作用，在保留胆酸可能的药效基团的基础上，对其侧链部位用氨基酸进行了结构修饰，合成了新的胆酸衍生物去氧胆酰酪氨酸(deoxycholyltyrosine，DCT)，相对分子质量558.0。DCT还具有较强的抗HIV-1活性，其 IC50为(21.50 ±3.2)mg·L－1，并可抑制 HIV逆转录酶活性［3］。也有研究报道，HIV病毒膜对DCT具有选择性的吸收，聚集于富含磷脂的HIV磷脂双分子层中，直接灭活HIV-1病毒［4］。至于DCT灭活人类精子，其抗精子靶标和作用机制目前还未见报道。

为探索DCT灭活人类精子的生物学特征，本研究利用荧光染色剂与流式细胞术相结合技术，从精子凋亡反应及质膜完整性(plasma membrane integrity，PMI)角度，对人类精子结构和功能状态特别是精子凋亡和质膜完整性进行检测。在传统显微镜检查和CASA分析常规评估终点的基础上，将DCT对精子药效从定性描述转化到定量的高通量多参数的分析，增加敏感特异的分子水平上的评价终点［5］，从而为下一步探讨DCT对精子作用的候选靶标以及设计新型外用避孕药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

精子培养液(Earle's balanced salt solution，EBSS);络合异硫氰酸荧光素(FITC)标记的AnnexinⅤ细胞凋亡试剂盒(美国Becton Dickinson公司);LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)(美国Invitrogen Molecular Probes公司);碘化丙啶(PI，美国Sigma公司);DCT，本课题组合成。计算机辅助精液分析系统(北京清华同方股份有限公司);流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司);荧光显微镜(BX41，日本Olypus);低速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)。

1.2 精液标本的采集

2012年12月－2013年4月就诊于上海市计划生育科学研究所医院门诊部的男性，年龄25～35岁，禁欲3～8 d，自慰法收集精液，取符合WHO标准的正常精液(在0.5 h内液化、精液量＞2 mL、pH值7.0 ～7.7、精子活率 ＞70%)用于本课题的研究。使用之前先用上游法进一步获得高活力精子，并将精子样本调节至密度为1×1010L－1备用。本研究经本研究所伦理委员会批准，精液标本捐献者知情同意，标本在完成实验后，全部高温杀灭。避免多人精液混合精子出现凝集，实验采用同一人的精样。

1.3 精子上游法获得高活力精子

将符合WHO标准的精液标本置于锥底离心管中，300 ×g 离心10 min，弃精浆，留0.2 ～0.4 mL沉淀精子液。取含8 mL EBSS(含0.4%牛血清白蛋白)的锥底离心管，将沉淀精子液小心加到EBSS液下方，并将试管倾斜40°置于37℃，5%CO2培养箱中孵育1.5 h。轻轻吸取试管上层呈云雾状含精子的EBSS液约2 mL。在300×g离心3 min，弃上清。用0.5 mL EBSS液重悬精子沉淀团，获得高活力精子悬液，调节精子密度为1×109L－1。

1.4 精子活率与运动参数的测定

取50 μL高活力精液，分别置入DCT终浓度分别为0，0.25，0.50 和1.0 g·L－1的96 孔板中，混匀。20 min后分别吸取混合后的精子悬液约10 μL用CASA进行分析，获得精子活率和(a+b)级精子活力的检测百分比。

1.5 流式细胞仪检测质膜完整性

将高活力精子样本用EBSS精子培养液调节密度为1×109L－1。取200 μL精子悬液分别置入含200 μL 37℃预温的EBSS空白溶液和DCT溶液(浓度分别为 0.25，0.50 和 1.0 g·L－1)的1.5 mL离心管中。于37℃，5%CO2孵箱避光孵育20 min，300 × g 离心 5 min，弃上清，用 400 μL EBSS精子培养液重悬。取其中200 μL悬液放入1.5 mL离心管中，加入 SYBR-14(终浓度100 nmol·L－1)和PI(终浓度12 μmol·L－1)各1 μL，混匀后 37℃，5%CO2孵箱孵育 20 min，离心，弃上清。再用EBSS精子培养液清洗2次，300×g离心5 min，除去游离多余荧光染料。最后用400 μL EBSS液重悬，经流式细胞仪检测。每份悬液样本获取10 000个精子。

1.6 荧光显微镜观察质膜完整性［6］

取1.5项SYBR-14/PI染色后的各组精子悬液10 μL涂于玻片上。空气干燥后，在400倍荧光显微镜下观察。每张涂片计数200个精子，以绿色荧光精子占检测精子百分率表示，计算检测样品精子质膜完整率，以质膜完整精子占检测精子总数百分率表示。

1.7 AnnexinⅤ/PI流式细胞仪分析精子凋亡

按照1.5项将精子与DCT混合后，吸取其中200 μL EBSS 精子悬液，加入 AnnexinⅤ-FITC 和PI各10 μL，混匀，于 37℃，5%CO2培养箱避光孵育20 min，300×g离心8 min，弃上清，用EBSS液洗涤2次。加入200 μL EBSS液重悬，通过流式细胞仪测定染色情况。每份样品记录10 000个精子。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 DCT对精子活率和活力的影响

DCT 0.25 g·L－1组精子活力和活率下降为空白对照组的1/2，DCT 0.50 g·L－1组活力和活率下降为空白对照的1/10 和1/20，1.0 g·L－1组几乎无存活精子存在(表1)。不同浓度DCT对精子活率和活力均具有明显的抑制作用(P＜0.05)，且是精子活率及活力均显示出随着DCT浓度的增加而降低的趋势(r活率=0.91，r活力=0.88，P ＜0.05)。

Tab.1 Effect of deoxycholyltyrosine(DCT)on sperm viability and motility

2.2 DCT对质膜完整性的影响

2.2.1 流式细胞仪结果

流式细胞仪检测结果(图1)及定量数据结果如表2所示，空白对照组活精子百分率显著高于DCT处理组(P＜0.05)。随着DCT浓度的增加，死亡精子百分率，即质膜破损精子百分率逐渐升高，DCT 0.25，0.5 和1.0 g·L－1时质膜破损的死精子百分率分别 为 (54.3 ± 9.8)%，(73.8 ± 3.5)% 和(80.6±8.3)%，与空白对照组具有明显差异(P＜0.05)，并具有较好的浓度依赖性(r=0.91，P ＜0.05)。实验结果表明，随着DCT浓度的升高，质膜损伤精子百分率逐渐升高，正常精子百分率出现下降趋势，DCT 0.50 g·L－1组濒死精子百分率较高，随着浓度升高濒死精子质膜逐渐被破坏成为坏死精子。

Fig.1 Effect of DCT on membrane integrity of human sperm by flow cytometry.See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L －1;D:DCT 1.0 g·L －1.

Tab.2 Effect of DCT on membrane integrity of human sperm

2.2.2 荧光显微镜观察

荧光显微镜观察显示，DCT作用后精子分为3个亚群，质膜完整的活精子呈边缘光滑均匀淡染的绿色荧光，为SYBR-14阳性染色(图2A);而死亡精子的质膜受损，染色剂PI进入精子内部与核染色，使之呈现均匀弥漫的红色荧光，为PI阳性染色(图2D);同时，染上并发出2种荧光的双阳性机子，正处于从活向死的过渡状态(图2B，C)。

Fig.2 EffectofDCT on membrane integrity by fluorescence microscopy(×400).See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L －1;D:DCT 1.0 g·L －1.

2.4 DCT对人精子凋亡的影响

图3及各象限数据结果(表3)结果显示，与空白对照组比较，DCT 0.5 g·L－1使精子的早期凋亡率升高到(9.7 ±0.7)%(P ＜0.05)，浓度为 1.0 g·L－1时，其早期凋亡率反而下降至(2.4±0.9)%，差异无统计学意义(P＞0.05)，说明DCT对精子早期凋亡率具有双向性。DCT 0.25，0.5 和1.0 g·L－1各组的人精子晚期凋亡率均明显升高，且差异有统计学意义(r=0.98，P ＜0.01)。

Fig.3 Effect of DCT on sperm apoptosis by AnnexinⅤ-FITC/PI staining.See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L－1;D:DCT 1.0 g·L －1.

Tab.3 Effect of DCT on apoptosis of human sperm

3 讨论

本研究显示，DCT对精子具有明显的杀伤作用，可望作为新型外用避孕药进行研发。随着DCT浓度的升高，精子活力、活率呈现下降趋势。质膜完整性检测结果显示，随着DCT浓度的升高，存活精子比例逐渐降低，死亡精子比例逐渐升高。DCT≤0.5 g·L－1引起精子早期凋亡率升高，但是高浓度时却出现降低趋势。精子晚期凋亡率随着浓度的升高呈现明显增高的趋势。

本研究发现，DCT 1.0 g·L－1可使精子的活力为0，不存在具有生殖能力的a级和b级精子。精子活率此时为(0.2±0.5)%，这主要是由活力较差的c级精子组成，其活力已不能够达到受精的要求。这一结果显示，DCT与现在市售的具有阴道刺激性的壬苯醇醚-9的杀精效能(最低杀精浓度0.35 g·L－1［7］)相似。

精子质膜是精子最外层的细胞结构，用以维持和调节胞内成分，其结构与生理的完整性对维持精子存活、运动和生化代谢是十分重要的［8］。本实验结果显示，DCT作用后质膜完整精子比例逐渐下降，质膜破损精子比例不断上升，提示DCT对精子的质膜具有明显的损伤作用。濒死精子比例不具有明显的浓度依赖性，这可能是因为随着DCT浓度升高，濒死状态的精子逐渐死亡，从而使得死亡精子比例升高有关。

凋亡不仅发生于睾丸生精上皮中的生精细胞，也可以发生在精子水平，但过度的凋亡可能是导致精子的受精能力下降的原因之一［9］。AnnexinⅤ检测精子凋亡结果表明，DCT处理组的精子晚期凋亡及坏死率均随浓度增高而升高，且具有浓度-效应关系。

DCT诱发人类精子凋亡，且以晚期凋亡增高为特点，且与精子质膜完整性实验结果基本一致，可能是随着DCT浓度升高，精子质膜结构发生变异加剧破损，膜渗透性增高，由早期凋亡转变为晚期凋亡及坏死精子，其活力和受精能力必然丧失，最后引起精子死亡。焦立飞等［10］认为，此凋亡可能与过自杀受体(Fas/FasL)途径或线粒体途径激活胱天蛋白酶，并作用到下游的酶切底物，进而产生一系列的级联反应，最终导致细胞凋亡有关。综上所述，DCT一类化学因素以浓度依赖性方式诱发精子“过度”凋亡而导致精子受精能力丧失。且均与精子质膜完整性、通透性和稳定性密切相关。

本研究采用定性和定量相结合的方法研究DCT对精子质膜和凋亡的影响，虽然采用多次实验的方法控制随机误差，但是鉴于机器对于声音和振动的敏感性，本实验活力和活率数据可能存在误差。另外，精子的凋亡受到多种基因的控制，应进一步探讨DCT作用于精子凋亡的线粒体途径及其相关调控基因如Fas/FasL和Bcl-2/Bax的表达。因此，DCT诱导致人类精子细胞凋亡的机制还有待于继续深入研究。

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