戈舍瑞林缓释植入剂在大鼠体内的药代动力学及药效动力学

张 枢，韩江彬，冷广意，沙春洁，刘万卉，

(1.烟台大学药学院，山东烟台 264005;2.山东绿叶制药有限公司长效和靶向制剂国家重点实验室，山东烟台 264003)

戈舍瑞林(goserelin)是人工合成的十肽，是促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的类似物，临床上主要适应证之一是治疗对激素依赖的前列腺癌［1］。其主要作用机制是作用于下丘脑-垂体-性腺轴系统，用药初期作用于垂体GnRH受体，刺激垂体释放卵泡刺激素和黄体生成素，从而导致性腺分泌睾酮增加，血中睾酮水平升高;长期用药后可导致GnRH受体脱敏，使黄体生成素及垂体释放卵泡刺激素的分泌减少，进而降低血中睾酮浓度至去势水平，抑制了前列腺癌细胞的生长，从而发挥其抗肿瘤作用［2－3］。因此，戈舍瑞林需制成缓释制剂，从而可以持续作用于受体，才能更好发挥药效。本文通过大鼠sc给予戈舍瑞林缓释植入剂，测定戈舍瑞林及其药效学指标睾酮在大鼠血浆中的浓度，探讨戈舍瑞林缓释植入剂在大鼠体内的药代动力学及药效动力学行为特征。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

醋酸戈舍瑞林对照药(肽纯度86%)，购自瑞士Bachem AG公司，2～8℃冷藏保存;睾酮对照品(98.5%)，购自德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;醋酸阿拉瑞林购自肽仕生物科技有限公司(上海);睾酮-d3和睾酮-13C3溶液购自美国Sigma公司;戈舍瑞林缓释植入剂，实验室自制;色谱纯甲醇购自美国Merck公司;乙酸、甲酸购自美国Fluka公司;Oasis®HLB小柱购自美国Waters公司;EP管，购自德国Eppendorf公司。

1.2 仪器及设备

QTRAP5500质谱仪，美国 ABSciex公司;1290高效液相系统，配制二元泵，美国Agilent公司;MilliQ超纯水制备仪，法国Molsheim公司;Fresco21冷冻离心机，英国Thermo Fisher公司。

1.3 动物

SD大鼠24只，雄性，体质量240～260 g，由山东绿叶制药有限公司实验动物中心提供，合格证号:SCXK(鲁)2009-0009。

1.4 给药方法及血样采集

将24只雄性SD大鼠随机分成3个实验组，分别采用每只0.3，0.6和1.2 mg 3个剂量，sc给药。分别在给药前(0 h)、给药后0.5，1，6 h及1，2，3，4，9，11，13，15，18，21，28，35和42 d采血。血液置于预冷的肝素化的抗吸附EP管中，混匀后，4℃，10 000×g离心5 min，取上清液分装至另两个抗吸附EP管中，至－80℃保存待测。

1.5 高效液相色谱-质谱测定条件

内源性物质睾酮的测定采用睾酮-d3为替代分析物［4－6］，以制备其标准曲线及质控样品。

色谱条件:戈舍瑞林和睾酮的色谱柱分别为ZORBAX Eclipse Plus C18柱和 ZORBAX Eclipse Plus C8柱(规格均为 Agilent，2.1 mm ×50 mm，1.8 μm，英国Stockport公司);戈舍瑞林流动相:B相为甲醇，A相为0.02%乙酸MilliQ水溶液;睾酮流动相:B相为甲醇，A相为甲酸铵1 mmol·L－1MilliQ水溶液(含0.1%甲酸);流速均为0.4 mL·min－1;柱温分别为40℃和30℃;进样量均为10 μL。

质谱条件:均采用电喷雾离子化源，正离子方式检测，扫描方式为多反应监测;戈舍瑞林源内参数为:离子喷射电压:5500 V;温度:550℃;源内气体1(N2)压力:40 psi;气体 2(N2)压力:50 psi.;气帘气体(N2)压力:30 psi;碰撞气:8 psi;睾酮源内参数为:离子喷射电压:5500 V;温度:600℃;源内气体1(N2)压力:45 psi;气体2(N2)压力:50 psi;气帘气体(N2)压力:40 psi;碰撞气:8 psi。戈舍瑞林和内标阿拉瑞林DP电压为40 V;CE电压为30 eV;睾酮，替代分析物睾酮-d3以及内标睾酮-13C3的DP电压均为87 V;CE电压均为26 eV;用于定量分析的离子反应为:戈舍瑞林，635.4/607.3，内标阿拉瑞林，584.5/249.1，睾酮 289.3/97.0，睾酮-d3，292.2/97.0，睾酮-13C3，292.2/100.2。

1.6 样品前处理条件

1.6.1 戈舍瑞林样品前处理条件

取100 μL 内标溶液(阿拉瑞林 10 μg·L－1)、50 μL大鼠血浆样品、100 μL 甲醇-水(60∶40)于1.5 mL离心管中，加入 300 μL 甲醇，涡流混合1 min，离心10 min(10 000×g)，取上层所有溶液至另一含400 μL水的2 mL离心管中，混匀，加入已经活化好的HLB固相萃取柱，以1 mL甲醇-水(60∶40，)洗杂质，1 mL 甲醇洗脱，洗脱液置于50℃水浴，氮气吹干。100 μL 甲醇-水(60∶40)复溶，涡流后取10 μL进样至液质系统。

1.6.2 睾酮样品前处理条件

取 100 μL 内标溶液(睾酮-13C310 μg·L－1)、50 μL大鼠血浆样品、100 μL 甲醇-水(60 ∶40)于10 mL离心管中，加入3 mL萃取液(正己烷∶二氯甲烷∶异丙醇2∶1∶0.1)，涡流混合 5 min，离心10 min(2800×g)，取上层所有溶液至另一离心管中置于 50℃ 水浴，氮气吹干。100 μL 甲醇-水(60∶40)溶解，涡流后取10 μL进样至液质系统。

1.7 统计学分析

采用Phoenix®WinNonlin®6.3软件，以非房室模型法处理分析戈舍瑞林的血药浓度-时间数据，计算药代动力学参数。采用SPSS17.0进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 高效液相色谱-质谱方法学验证

2.1.1 专属性

取6只大鼠空白血浆，以稀释液分别代替标准溶液和内标，其余项按照1.6.1项处理，得色谱图1-A;将一定浓度的戈舍瑞林标准溶液和内标阿拉瑞林溶液加入空白血浆样品，依样品前处理项操作，得色谱图1-B。按照1.6.1项处理给药后样品，得色谱图1-C。结果表明，空白血浆中的内源性物质，不干扰戈舍瑞林和内标阿拉瑞林的测定。色谱图2结果表明，空白血浆中的其他内源性物质不干扰睾酮的测定。

Fig.1 Typical multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of goserelin(Ⅰ)and alarelin(Ⅱ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

Fig.2 Typical MRM chromatograms of testosterone-d3(Ⅰ)，testosterone-13C3(Ⅱ)，testosterone(Ⅲ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

2.1.2 标准曲线

取空白血浆制成一定浓度的戈舍瑞林及睾酮-d3标准系列溶液，戈舍瑞林:0.03，0.10，0.30，1.00，3.00，10.0 和 30.0 μg·L－1;睾酮-d3:0.05，0.10，0.30，1.0，3.0，10.0 和30.0 μg·L－1。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得戈舍瑞林标准曲线为 y=0.221x+0.00114，r=0.9992，睾 酮-d3标 准 曲 线 为y=0.0452x+0.00353，r=0.9993。

2.1.3 精密度

分别制备戈舍瑞林0.05，1.00 和24.0 μg·L－1和睾酮-d30.10，1.00 和24.0 μg·L－1的质量控制样品，每浓度6样本，连续测定3 d。戈舍瑞林日内相对标准差分别为3.07%，1.05%和6.64%;日间相对标准差分别为6.92%，3.44%和2.32%。睾酮-d3日内相对标准差分别为2.76%，1.80%和4.38%;日间相对标准差分别为3.00%，2.70%和2.13%。

2.1.4 提取回收率及基质效应

质量控制样品得到的色谱峰面积与空白基质提取后添加相应浓度标准溶液进样的色谱峰面积相比，计算3个浓度(每浓度4样品)质量控制样品的提取回收率。戈舍瑞林的提取回收率分别为66.9%，65.4%和 67.4%，睾酮-d3的提取回收率分别为97.5%，96.9%和99.1%。空白基质提取后添加相应浓度标准溶液进样的色谱峰面积与相应标准溶液峰面积相比，计算3个浓度(每浓度4样品)质量控制样品的基质效应。戈舍瑞林的基质效应分别为99.0%，100.2%和98.3%，睾酮-d3的基质效应分别为 102.5%，100.7%和 99.9%。

2.1.5 稳定性

戈舍瑞林和睾酮的大鼠血浆样品经历3次冷冻-解冻循环，室温放置3 h，在－80℃下放置60 d以及样品经处理后室温放置10 h后的稳定性。所有样品的相对标准偏差绝对值均小于15%，表明大鼠血浆样品中戈舍瑞林和睾酮在以上所有条件下均稳定。

2.2 戈舍瑞林缓释植入剂在大鼠的血药浓度-时间曲线及其药代动力学

大鼠皮下注射给予3个剂量戈舍瑞林缓释植入剂后的平均血药浓度-时间曲线见图3。给药初期，血药浓度迅速上升，出现第一个峰值，其后缓慢释放，在大约9～11 d达到第二个峰浓度。采用非房室模型进行拟合获取药代学参数，计算结果见表1。采用线性回归对3个剂量的AUC0－t和cmax进行回归分析，AUC0－t和 cmax线性回归相关系数分别为r=0.942， P=0.000 ＜0.01， r=0.923，P=0.000＜0.01，结果表明线性回归有意义。药峰时间(Tmax)，半衰期(t1/2)，平均滞留时间(MRT)，清除率(Cl)与表观分布容积(Vd)采用单因素方差分析显示不同剂量组间均无显著性差异。

Fig.3 Plasma concentration-time curves of goserelin in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

2.4 戈舍瑞林缓释植入剂在大鼠的药效动力学

大鼠皮下注射给予3个剂量戈舍瑞林缓释植入剂后，体内睾酮浓度变化趋势如图4。各组睾酮浓度变化趋势表现为:给药初期显著上升，4 d后降至低浓度水平，给药后28～35 d恢复至正常水平。在每只0.3 mg水平下，大鼠给药4 d后睾酮浓度下降至较低水平，但未完全达到理论去势水平，给药后21 d起，睾酮浓度即逐渐上升至正常水平。在每只0.6～1.2 mg水平下，大鼠给药4 d后，睾酮浓度均能降低至理论去势水平，且能够维持至第28天。

Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of goserelin sustained-release implant in rats by subcutaneous injection

Fig.4 Plasma concentration-time curves of testosterone in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

3 讨论

与已知戈舍瑞林的测定方法［7－8］相比，采用替代分析物法制备标曲及质控样品测定睾酮。最低定量下限优于文献报道的 0.1 ng·mL－1，且专属性好，更适用于低浓度戈舍瑞林样品的测定。方法学数据表明，两种方法均符合生物样本测定［9］的要求，可用于戈舍瑞林的体内药代动力学及药效动力学的分析。

戈舍瑞林缓释植入剂在大鼠体内的血药浓度-时间曲线显示其有2次达峰行为，初始峰值的产生是由于植入剂表面药物的快速释放，从而使得血药浓度迅速达到较大水平，第2次达峰是由于植入剂骨架溶蚀，进一步崩解而得。每只0.3～1.2 mg剂量范围内，随着剂量的增加，药代参数 AUC0－t和cmax呈线性增加，其他参数 Tmax，t1/2，MRT，Cl与Vd在不同剂量组间均无显著性差异。提示该植入剂在大鼠体内的药动学行为在每只0.3～1.2 mg的剂量范围内呈线性药代动力学特性。

在每只0.3～1.2 mg剂量范围内，睾酮变化趋势相近，随着剂量的增加，大鼠体内药效学结果并未呈现出良好的量效关系。在每只0.3 mg剂量水平的作用下，大鼠给药4 d后睾酮浓度虽下降至较低水平，但未完全达到理论去势水平，提示该制剂在此浓度水平下，未能达到预期药效水平。在每只0.6～1.2 mg剂量范围内，大鼠给药4 d后，各剂量组的睾酮浓度均能降低至理论去势水平，睾酮变化趋势无明显不同，维持药效至28 d。提示该制剂在每只0.6 mg以上剂量水平的作用下，对大鼠垂体GnRH受体产生长时间刺激后，导致受体完全脱敏，使得睾酮浓度达到去势水平，此时达到预期药效作用。

根据该制剂在大鼠体内的药代动力学及药效动力学研究结果表明，其药效作用的产生及维持可能与戈舍瑞林的初始刺激及后续的维持浓度有关。戈舍瑞林的初始刺激达到一定强度时，一段时间后均能使大鼠垂体GnRH受体达到脱敏状态，进而完全抑制睾酮浓度达去势水平。后续实验可对多种不同制剂处方的药代动力学与药效动力学进行研究，进一步增加样本量，以确定两者间的相关性。

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［9］Guideline on Bioanalytical Method Validation，European Medicines Agency，2011［B/OL］.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf.