人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

符静，徐小洁，刘家宏，，田沛荣，范忠义，吕朝晖，王涛，朱建华，陆菊明，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放军总医院 内分泌科，北京 100853；3.解放军总医院第一附属医院，北京 100039

人转录激活因子5（activating transcription fac⁃tor 5，ATF5）属于转录因子ATF/CREB家族，具有碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，B-ZIP）特异性结构域[1]，在细胞的生长、增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[2]。ATF5能促进肿瘤存活[3-4]，在神经胶质瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、前列腺癌组织中表达上调[4-7]，而在一些肿瘤中降低ATF5表达后会导致肿瘤细胞的死亡[3-9]，对正常细胞则没有明显作用。这提示ATF5在肿瘤细胞的生长、增殖和死亡中起重要作用。此前，ATF5与肿瘤关系的研究大多集中于ATF5在凋亡中的作用，而最近的一项研究[10]表明，在慢性粒细胞白血病细胞中，ATF5能够通过升高雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）的水平抑制自噬。

我们拟构建ATF5的真核表达载体，并验证其升高mTOR水平的功能，为进一步研究ATF5与自噬的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞由本室传代培养；pXJ-40-myc载体为本实验室保存；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂均购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购自Promega公司；DMEM及小牛血清均购自Gibco公司；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 myc-ATF5重组质粒的构建与测序

以本实验室保存的XL5-ATF5质粒作为模板，根据文献报道的ATF5的编码序列合成引物。上游引物为5'-CGGGATCCATGTCACTCCTGGCGACCC TGG-3'，下游引物为5'-CCCAAGCTTCTAGCAGCT ACGGGTCCTCTGGCTC-3'。利用PCR方法扩增人ATF5的编码序列，按以下条件进行片段的扩增：95℃预变性5 min，然后以95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min进行31个循环，72℃延长7 min。用胶回收试剂盒回收PCR产物。

用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pXJ-40-myc载体，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成带有粘端的双链，用T4DNA连接酶连接入pXJ-40-myc载体中；转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，摇菌并提质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.3 哺乳动物细胞转染和Western印迹检测

按常规方法进行转染，用不含双抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基将293T细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。将4 μL VigoFect与200 μL NaCl混合，再将总量为10 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，并以同样方法转染空pXJ-40-myc载体作为对照，37℃、50 mL/L CO2常规培养，4～6 h换液。质粒转染293T细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2×SDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的用HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。转染重组质粒和空载体后，用上述方法行Western印迹至5%脱脂奶粉，于4℃封闭过夜后，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的抗mTOR的兔多克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用5%脱脂奶粉稀释的以1∶5000稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.4 总RNA提取

分别转染了重组质粒和空载体的细胞弃培养基，1×PBS洗涤，用1 mL TRIzol溶液吹下细胞，加0.2 mL氯仿提取蛋白混匀，室温放置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量异丙醇混匀，-20℃冷冻10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇（DEPC水稀释）洗1次，4℃、12 000 r/min离心5 min后弃上清，用无水乙醇洗1次，4℃、12 000 r/min离心5 min后弃上清，自然干燥RNA约30 min，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，即为提取的总RNA。

1.5 qRT-PCR检测

取2 μg总RNA，与1 μL 50 μmol/L的随机引物混匀，补水至15.9 μL，70℃解链5 min，自然冷却至室温，加入反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂及反转录缓冲液，剩余补水至终体积25 μL，42℃反应1 h，95℃灭活5 min，得到反转录的cDNA第一链，将其1∶20稀释，取9.2 μL模板与10 μL SYBR Green Mix（2×）、上下游引物各0.4 μL混匀进行qRT-PCR，所得数据按2-ΔΔCt公式计算出基因表达的相对量。

2 结果

2.1 myc-ATF5重组质粒的构建与鉴定

以实验室保存的XL5-ATF5质粒为模板，PCR扩增人ATF5的编码序列，获得长约850 bp的DNA片段，与预期片段大小一致（图1）。将PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与经同样酶切的pXJ-40-myc载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，进行菌液PCR鉴定，若获得与目的条带850 bp大小接近（图2）的克隆，则初步认为是带有人ATF5基因的阳性重组克隆。将所得阳性克隆提质粒经酶切鉴定，可切出2条长度分别约为5000和850 bp的条带，而相应的空载体酶切只见大片段，符合预期结果（图3）。测序结果表明，插入片段的DNA序列与人ATF5基因的编码序列完全一致（数据略）。

2.2 Western blot检测myc-ATF5及mTOR在293T细胞中的表达

将构建的myc-ATF5重组质粒和空载体分别转染293T细胞系，24 h后提取蛋白进行SDS-PAGE，Western印迹检测myc-ATF5和mTOR的表达。结果显示，转染重组质粒后，用myc-HRP抗体能够在相对分子质量约40×103处检测到明显的特异性条带，空载体无条带；与空载体对照相比，转染重组质粒后mTOR蛋白水平升高（图4）。说明myc-ATF5重组蛋白在293T细胞中能正确表达，且能升高mTOR的蛋白水平。

2.3 ATF5在mRNA水平升高mTOR

收集转染了myc-ATF5和空载体的293T细胞，提取总RNA，行qRT-PCR，引物采用文献报道的序列[10]。结果显示，转染myc-ATF5后，mTOR的mRNA水平明显升高（图5）。

图1 PCR扩增人ATF5的编码序列

图2 重组质粒myc-ATF5的菌液PCR结果电泳图谱

图3 重组质粒myc-ATF5的BamHⅠ/HindⅢ双酶切电泳图谱

3 讨论

ATF5是核转录因子ATF/CREB家族的成员，该家族成员均包含特征性B-ZIP的C端cAMP效应元件（cAMP responsive element，CRE）。作为 cAMP/PKA通路的核内信号转导分子，ATF/CREB能对许多生长因子及肽类激素的刺激做出反应，通过与多种蛋白质结合为同源或异源二聚体而发挥转录活性，参与细胞生长、分化、应激和凋亡等重要生命过程[1]。其中ATF5位于染色体19ql3.33，其编码的蛋白含有282个氨基酸残基，此蛋白由含有B-ZIP（209～269残基）的C端序列、中央富含脯氨酸的DNA转录激活区和非保守的N端序列构成，其中BZIP是ATF5与特异性DNA序列结合的功能区域[11]。

ATF5的功能复杂，目前尚未完全阐明。现有研究表明ATF5参与神经祖细胞、肝细胞等的分化，参与细胞增殖、凋亡、应激的调控[12-15]。最近的研究报道，在BCR-ABL基因易位的慢性髓样白血病细胞中，发现PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR信号通路，由此首次发现了ATF5调控自噬的功能[9]。在此通路中，AKT磷酸化FOXO4，使其从细胞核内移出，隔离在胞质区，阻碍其调节靶基因的转录。ATF5是FOXO4的下游基因，FOXO4功能被AKT抑制后，对ATF5的转录抑制减弱，使得ATF5在转录水平升高。ATF5可与mTOR结合而升高mTOR的水平，因此抑制自噬。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象，贯穿于正常细胞生长发育和多种生理病理过程。自噬在肿瘤的发生、发展和治疗中都起重要作用。自噬的调控主要受位于ATG上游的PI3K-mTOR信号转导通路和Beclin 1复合物调节[16-17]，其中PI3K-mTOR通路是自噬活性调节的核心。在BCR-ABL基因易位的慢性粒细胞白血病细胞中，被ATF5升高的mTOR，与PI3K/AKT通路中其他成员激活的mTOR一起抑制自噬。

图4 Western印迹检测myc-ATF5和mTOR的表达

图5 qRT-PCR检测ATF5对mTOR的影响

本实验构建的myc-ATF5在真核细胞中获得了表达，并验证了表达的融合蛋白能够在mRNA和蛋白水平升高mTOR。ATF5在真核细胞中的成功表达，是继续深入研究其在自噬中的作用机制，以及探讨其利用价值的基础。

[1]Hai T,Hartman M G.The molecular biology and nomencla⁃ture of the activating transcription factor/cAMP responsive ele⁃ment binding family of transcription factors:activating tran⁃scription factor proteins and homeostasis[J].Gene,2001,273(1):1-11.

[2]Persengiev S P,Green M R.The role of ATF/CREB family members in cell growth,survival and apoptosis[J].Apoptosis,2003,8(3):225-228.

[3]Monaco S E,Angelastro J M,Szabolcs M,et al.The tran⁃scription factor ATF5 is widely expressed in carcinomas,and interference with its function selectively kills neoplastic,but not nontransformed,breast cell lines[J].Int J Cancer,2007,120(9):1883-1890.

[4]Sheng Z,Li L,Zhu L J,et al.A genome-wide RNA interfer⁃ence screen reveals an essential CREB3L2-ATF5-MCL1 sur⁃vival pathway in malignant glioma with therapeutic implications[J].Nat Med,2010,16(6):671-677.

[5]Ayers M,Symmans W F,Stec J,et al.Gene expression pro⁃files predict complete pathologic response to neoadjuvant pacli⁃taxel and fluorouracil,doxorubicin,and cyclophosphamide che⁃motherapy in breastcancer[J].JClin Oncol,2004,22(12):2284-2293.

[6]Barden C B,Shister K W,Zhu B,et al.Classification of fol⁃licular thyroid tumors by molecular signature:results of gene profiling[J].Clin Cancer Res,2003,9(5):1792-1800.

[7]Dong S,Nutt C L,Betensky R A,et al.Histology-based ex⁃pression profiling yields novel prognostic markers in human glioblastoma[J].J Neuropathol Exp Neurol,2005,64(11):948-955.

[8]Li Y,Hong X,Hussain M,et al.Gene expression profiling re⁃vealed novel molecular targets of docetaxel and estramustine combination treatment in prostate cancer cells[J].Mol Cancer Ther,2005,4(3):389-398.

[9]Angelastro J M,Canoll P D,Kuo J,et al.Selective destruc⁃tion of glioblastoma cells by interference with the activity or expression of ATF5[J].Oncogene,2006,25(6):907-916.

[10]Sheng Z,Ma L,Sun J E,et al.BCR-ABL suppresses autoph⁃agy through ATF5-mediated regulation of mTOR transcription[J].Blood,2011,118(10):2840-2848.

[11]Vinson C,Myakishev M,Acharya A,et al.Classification of human B-ZIP proteinsbased on dimerization properties[J].Mol Cell Biol,2002,22(18):6321-6335.

[12]Pascual M,Gomez-Lechon M J,Castell J V,et al.ATF5 is a highly abundant liver-enriched transcription factor that coop⁃erates with constitutive androstane receptor in the transactiva⁃tion of CYP2B6:implications in hepatic stress responses[J].Drug Metab Dispos,2008,36(6):1063-1072.

[13]Wei Y,Jiang J,Sun M,et al.ATF5 increases cisplatin-in⁃duced apoptosis through up-regulation of cyclin D3 transcrip⁃tion in HeLa cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(2):591-596.

[14]White J H,Mclllhinney R A,Wise A,et al.The GABAB re⁃ceptor interacts directly with the related transcription factors CREB2 and ATFx[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13967-13972.

[15]WangH,Lin G,ZhangZ.ATF5 promotescellsurvival through transcriptional activation of Hsp27 in H9c2 cells[J].Cell Biol Int,2007,31(11):1309-1315.

[16]Yang Z,Klionsky D J.An overview of the molecular mecha⁃nism of autophagy[J].Curr Top Microbiol Immunol,2009,335(1):1-32.

[17]Pattingre S,Espert L,Biard-Piechaczyk M,et al.Regulation of macroautophagy by mTOR and beclin 1 complexes[J].Bio⁃chimie,2008,90(2):313-323.