PinX1的原核表达、纯化及其与hTERT的相互作用

廉攀峰，程龙，关鑫，邹大阳，梅玲，李俊杰，张菊会，王恩群，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.安徽医科大学 附属安庆市立医院口腔科，安徽 安庆 246003

Pin2/TRF1结合蛋白X1（Pin2/TRF1-interacting protein X1，PinX1）是一种新型的Pin2/TRF结合蛋白，其编码基因位于染色体8p22-23区域。PinX1近来被鉴定为一个新型抑癌基因[1-2]，其发挥作用的机制是以其TID结构域与人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）结合而抑制端粒酶活性，调控端粒长度并调节肿瘤的发生发展。有研究表明，PinX1在许多人类癌细胞中有高频率杂合性缺失（LOH），胃癌、大肠癌及白血病患者的PinX1表达水平明显下降，而在这些癌组织中端粒酶活性显著增强[3-5]。然而，PinX1基因在肿瘤细胞中对端粒酶活性的调控，以及在细胞癌变中的具体作用机制目前尚不十分清楚。

为进一步探讨PinX1对端粒酶活性的调节及其分子机制，进而研究PinX1基因在正常细胞和肿瘤细胞中的功能，我们构建了PinX1基因的原核表达载体，并进行了表达、鉴定和纯化，此外还验证了原核表达的PinX1蛋白与hTERT的相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞293T、大肠杆菌BL21、克隆载体pET-32a由本室保存；hTERT表达载体FLAG-hTERT由黄君健教授赠送；Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收试剂盒均为Promega公司产品；His抗体购自Sigma公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；测序由北京博迈德生物技术有限公司完成。

1.2 PinX1基因片段的扩增

以乳腺文库为模板，根据GenBank中PinX1基因（NM_017884）序列设计扩增用上游引物（5'-CG GAATTCATGTCTATGCTGGCTGAACG-3'）和下游引物（5'-CCCAAGCTTTTTGGAATCTTTCTTCTTCTTC T-3'），上下游引物分别携带EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。扩增条件：95℃预变性5 min，按95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.5 min进行30个循环，72℃延伸7 min。

1.3 pHis-PinX1质粒的构建与测序

在37℃下，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pET-32a载体4 h，经琼脂糖凝胶电泳后，回收载体大片段；将PCR产物回收后再用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，用T4DNA连接酶连接入pET-32a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选阳性克隆，振荡培养并提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的克隆送北京博迈德生物技术有限公司测序。

1.4 His-PinX1蛋白的诱导表达

将构建的表达PinX1的重组质粒和表达His的空载体pET-32a转化大肠杆菌BL21，转化子于37℃振荡过夜，再按2%的接种量转接到5 mL含氨苄西林的LB培养基中，37℃培养2～3 h，当D600nm值达到0.6～0.8后，加入IPTG至终浓度为0.1 mol/L，于37℃继续诱导培养4 h，4℃、3000 r/min离心10 min，收集菌体，加入2×SDS-PAGE缓冲液后电泳鉴定。

1.5 表达产物的鉴定

图1 目的基因的PCR扩增

采用Western印迹鉴定His-PinX1。样品经SDS-PAGE后转移到硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂奶粉于室温封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的His单克隆抗体，室温轻摇1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，用化学反光法显色5 min，压片显影。

1.6 His-PinX1蛋白的纯化

收集上述诱导菌，利用His-PinX1蛋白可结合His磁珠的特点，用His磁珠颗粒纯化PinX1融合蛋白。即按10∶1的比例加入细胞裂解液（50 mmol/L Tris-HClpH7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.3 mmol/L DTT，1 g/L NP-40，蛋白酶抑制剂），超声波破碎，离心收集上清液，加入适量His磁珠颗粒，4℃旋转结合4 h，再收集His磁珠颗粒，充分洗脱未结合的蛋白质，即得到结合有His-PinX1蛋白的磁珠颗粒。

1.7 PinX1与hTERT的相互作用分析

将人胚肾细胞293T以70%密度，用不含双抗、含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养基接种于直径6 cm的培养皿中，培养24 h后，按Vigofect说明书转染方法将带Flag标签的hTERT真核表达质粒转入293T细胞，4～6 h后换培养基，37℃、5%CO2常规培养24 h后收集细胞加入IP缓冲液500 μL，冰上裂解细胞30 min，超声波破碎细胞后4℃、12 000 r/min离心10 min，将纯化的His-PinX1融合蛋白加到细胞裂解液中，4℃旋转结合3～6 h后3000 r/min离心收集珠子，用缓冲液充分洗脱未结合蛋白，West⁃ern印迹检测2种蛋白质之间的直接相互作用。

2 结果

2.1 PinX1基因片段的PCR扩增

以乳腺文库为模板，PCR扩增PinX1基因序列，扩增产物约980 bp，与预期片段大小一致（图1）。

2.2 重组质粒的酶切鉴定

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pHis-PinX1，得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段（图2），而对照pET-32a经同样双酶切后无插入片段，说明克隆成功。序列测定证明，His-PinX1编码区序列完全正确（数据略）。

图2 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒

2.3 His-PinX1的诱导表达

将重组质粒和pET-32a分别转化大肠杆菌BL21，转化菌经IPTG诱导，SDS-PAGE检测结果表明，转化重组质粒的工程菌在相对分子质量约57×103处有特异性表达条带（图3）；Western印迹鉴定表明，这些特异性表达带可与His抗体发生特异反应，说明His-PinX1重组菌成功表达了His-PinX1蛋白（图4）。

2.4 His-PinX1蛋白的纯化

含有重组质粒pHis-PinX1的转化菌经19℃诱导表达，并经His磁珠亲和纯化后，获得了高纯度目的蛋白（图5）。

2.5 PinX1与hTERT相互作用分析

为进一步证实纯化的His-PinX1可与hTERT蛋白在体外直接相互作用[1]，将带有His-PinX1的纯化珠子与过量表达Flag-hTERT的293T细胞裂解液于4℃结合后进行Western印迹，结果显示与His空珠子孵育的样品利用Flag-HRP抗体检测无特异条带，而与His-PinX1珠子孵育的样品能检测到特异的hTERT蛋白条带（图6），说明PinX1蛋白与hTERT蛋白能够特异地相互作用。

3 讨论

端粒酶是一种特殊的逆转录酶，由RNA模板和发挥催化作用的酶组成，可调节端粒长度。近年来对端粒酶进行了大量研究，表明端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关，且端粒酶表达水平与肿瘤的预后有关[6-9]。端粒、端粒酶对肿瘤细胞的发生发展起着重要作用。研究表明，PinX1可直接结合于端粒酶的RNA组分，阻断端粒酶RNA，从而使其丧失活性，破坏其模板功能，导致端粒酶活性的下降和端粒的缩短，从而发挥抑癌基因的作用[10-13]。

图3 SDS-PAGE检测His-PinX1的表达

图4 Western印迹鉴定His-PinX1的表达

我们以人乳腺文库DNA为模板，克隆得到PinX1基因，构建了原核表达载体pHis-PinX1，SDSPAGE和Western印迹检测证明我们构建的His-PinX1表达成功。在人肾胚细胞293T中转染并纯化得到hTERT蛋白后，检测证实PinX1与hTERT存在相互作用。下一步实验将深入探讨PinX1与hTERT的相互作用定位，以及PinX1抑制端粒酶活性的分子机制，为探讨PinX1基因在调节肿瘤发生发展中的意义奠定基础。

图5 His-PinX1蛋白的纯化

图6 Western印迹检测PinX1蛋白与hTERT蛋白的相互作用

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