炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

李强，刘先凯，冯尔玲，朱力，王沛，王红，杨新华，赵美玲，姜永强，王恒樑

1.白求恩医务士官学校，河北 石家庄 050081；2.军事医学科学院 a.生物工程研究所；b.微生物流行病研究所，北京 100071

炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）的芽胞侵入动物或人体可引起包括皮肤炭疽、胃肠道炭疽、肺炭疽在内的3种类型的炭疽疾病，并可被巨噬细胞吞噬而萌发，最终入血导致败血症，是一种非常重要的人畜共患病病原体[1]。炭疽杆菌的芽胞对繁殖体形式不易生存的环境，如干燥、高温、紫外线、电离辐射、极端pH值等的抵抗力极强，提高了菌体感染人或动物的几率；且炭疽杆菌的芽胞是其主要感染形式，并可制备为气溶胶而大面积扩散，成为生物战剂的首选。2001年10月发生的生物恐怖袭击中使用了炭疽芽胞，引起了全世界对于炭疽杆菌芽胞研究的关注[2]。

细菌芽胞形成是菌体分裂的一种特殊形式。我们前期的蛋白质组学研究发现FtsE蛋白在炭疽杆菌芽胞形成过程中明显上调，提示其可能在芽胞形成过程中发挥了重要作用[3]。Garti-Levi等在枯草芽胞杆菌芽胞形成研究中发现，FtsE蛋白不仅可作为ABC转运子摄取外界环境信号，激活Spo0A并起始芽胞形成过程，而且对芽胞形成过程中的不对称分裂起到了关键作用[4]。

为研究炭疽芽胞杆菌中FtsE蛋白的功能，我们利用基因工程技术将其编码序列克隆到原核表达载体，进行了可溶性诱导表达，并优化了亲和层析法大量纯化FtsE蛋白的条件，获得了高纯度目的蛋白，为下一步功能研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

炭疽杆菌减毒株A16R由军事医学科学院菌种中心提供；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）和表达载体pET-28a为本室保存；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；鼠源抗-His抗体购自Pharmacia公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；质粒快速提取试剂盒购自Promega公司；蛋白定量试剂盒购自Amer⁃sham公司；蛋白胨与酵母提取物购自OXOID公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自BBI公司；PEG20000、过硫酸铵、TEMED、EDTA二钠盐、十二烷基磺酸钠（SDS）、考马斯亮蓝G-250、RNase A等购自AMRESCO公司。

低温离心机为SIGMA 3K12；酶联检测仪型号为SS-3000；超声破碎仪为SONICS VC 750型；国产脱色摇床；GeneAmp PCR system为Applied Biosys⁃tems产品；凝胶成像分析仪为TANSILLUMNATOR公司产品；垂直电泳仪购自Amersham公司；蛋白半干电转仪为Bio-Rad公司产品；AKTA FPLC及 Ni-NTA产自Pharmacia公司。

1.2 构建融合表达载体pET28a-ftsE

调取GenBank中炭疽芽胞杆菌ftsE基因序列，利用Primer premier软件，于此基因上下游末端分别插入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点，设计引物（由奥科生物技术公司合成）F（5'-CCGGAATTCATGAAAGCC ATTGCTGGTCT-3'）和 R（5'-CCCAAGCTTGCCTTC ATATCCGTATCCTC-3'）。

PCR扩增（50 μL反应体系）参数为94℃ 变性10 min，之后以94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min进行30个循环，最后72℃延伸10 min。用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，将PCR产物及pET28a质粒分别于37℃水浴条件下用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切6 h，用凝胶回收试剂盒回收后在凝胶成像分析仪下定量；根据Novagen pET system Man⁃ual，配制扩增产物与pET载体连接反应体系，16℃反应过夜；将2 μL重组连接反应产物用化学转化法转化到33 μL大肠杆菌DH5α感受态后涂LB（Kan+）平板，分别挑取数个pET-ftsE转化子进行菌落PCR鉴定；对阳性克隆纯培养后提取质粒，双酶切鉴定正确的质粒由奥科公司测序鉴定。

1.3 融合蛋白的诱导表达与Western印迹鉴定

将pET-ftsE重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌BL21（DE3），获得表达外源蛋白的重组大肠杆菌BL21（pET-ftsE），挑取LB（Kan+）平板上的单个重组菌落，接种于5 mL LB（Kan+）液体培养基中，37℃培养10 h，然后取1%接种到新鲜LB（Kan+）液体培养基中，37℃培养140 min后，加入不同浓度的IPTG诱导表达2～4 h，离心收集菌体，煮沸5 min后12 000 r/min离心2 min，取5 μL样品行SDS-PAGE，80 V恒压电泳20 min后，120 V恒压电泳3 h，取凝胶置于染色液中染色30 min，然后用高甲醇脱色液（45%甲醇，47%水，8%冰乙酸）脱色2 h，低甲醇脱色液（5%甲醇，87%水，8%冰乙酸）脱色4 h，观察融合蛋白的表达情况。

取微量融合蛋白与等体积2×SDS缓冲液充分混匀，煮沸5 min，离心后取12 μL上样电泳，将分离的蛋白通过半干电转仪转移到硝酸纤维素膜上，恒压15 V转移1.5 h；用5%脱脂奶粉封闭1 h后，以抗-His抗体为一抗，室温封闭1.5 h，洗膜3次后以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温封闭后吸净PVDF膜表面液体，ECL显色系统显色5 min后用X线胶片在暗室中曝光检测目的蛋白。

1.4 优化融合蛋白的可溶性表达

分别在14、20、30℃条件下用终浓度分别为0.1、0.4、0.5、1.0 mmol/L的IPTG诱导1～4 h，对诱导产物的上清及沉淀分别行SDS-PAGE检测，筛选融合蛋白可溶性表达的条件。

1.5 表达产物的镍柱纯化

按照筛选的诱导条件，将表达融合蛋白的工程菌用IPTG诱导3 h，将2000 mL培养液于4℃条件下8000 r/min离心15 min，收集菌体，重悬于20 mL Ni-NTA柱结合缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂，在30%总功率条件下，冰浴超声波破碎20 min（超声2 s，停2 s），4℃、5000 r/min离心30 min，收集上清。

依次用8倍柱体积的双蒸水、4倍柱体积的1 mol/L NaCl、16倍柱体积的双蒸水、8倍柱体积的结合缓冲液缓推过Ni-NTA柱，置4℃冰箱中备用。

处理好的柱子UV约为50，上样3 mL/min至总体积200 mL；用Ni-NTA柱结合缓冲液洗柱3 mL/min，至UV为52；用Ni-NTA柱洗涤缓冲液洗柱3 mL/min，至UV为56；分别用3.3%、10%、20%、30%、50%、70%、100%的洗脱缓冲液洗5个柱体积，收集液体，每管收集1 mL洗脱液，每隔5管取少量洗脱液进行电泳验证，检测纯化蛋白的纯度和蛋白量。

2 结果

2.1 ftsE基因的PCR扩增

GenBank中ftsE基因片段长度为645 bp。由图1可见，扩增出的片段长度与预计相符。

2.2 重组质粒pET28a-ftsE的构建

将表达载体pET28a与ftsE基因的PCR产物分别双酶切后，连接并转化大肠杆菌，挑取转化子提取质粒。将重组质粒pET28a-ftsE用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，结果如图2，1、2、4泳道出现2条电泳带，其中一条分子大的电泳带与载体pET-28a位置相同，另一条分子小的电泳带则位于600 bp左右，与ftsE基因的PCR产物大小相同。

2.3 重组质粒中ftsE基因的核苷酸序列分析

对酶切鉴定正确的菌株传代保存，并挑取单菌落培养10 h后，取1.5 mL菌液送奥科公司测序。测得的ftsE基因的核苷酸序列与GenBank中BA5416序列相同，编码框架完全正确。

2.4 重组蛋白的SDS-PAGE分析及Western印迹

含重组质粒pET-ftsE的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，于4℃、5000 r/min离心取菌体，溶解于Ni-NTA柱结合缓冲液后超声波破碎，10 000 r/min离心后分别取上清和包涵体进行SDS-PAGE检测，分析重组FtsE蛋白在大肠杆菌中的表达情况。取微量融合蛋白以抗-His抗体进行Western印迹，发现目的蛋白表达正确（图3）。进一步对表达的温度和诱导的IPTG浓度等条件进行摸索，发现在20℃、0.1 mmol/L IPTG诱导条件下的表达产物主要是可溶性蛋白。

图1 PCR扩增得到ftsE基因

图2 重组质粒的酶切鉴定

2.5 重组FtsE蛋白的分离纯化

经过不断摸索诱导表达条件，在20℃，0.1 mmol/L条件下表达的FtsE主要以可溶性形式存在。将制备得到的全菌体溶液上清用Ni-NTA纯化进行亲和层析，然后用不同浓度的咪唑洗脱缓冲液梯度洗脱得到纯化产物，共得到80管液体，每管1 mL，从中取微量蛋白进行SDS-PAGE，结果见图4。

3 讨论

对大肠杆菌的FtsE蛋白的大量研究表明，其通过参与构建并稳固菌体分裂环及水解细胞壁，在菌体细胞分裂中发挥了重要作用，是菌体分裂相关蛋白[5-6]。对肺炎球菌FtsE蛋白的研究发现，其通过与PCB蛋白的相互作用，参与细胞分裂[7]。对脑膜炎球菌FtsE蛋白的研究发现，其通过与DNA结合，参与摄取外源DNA而进行基因转化[8]。对枯草芽胞杆菌芽胞形成的研究认为，FtsE蛋白作为ABC转运子，参与摄取外源信号物质，起始芽胞形成过程，并在芽胞形成过程中参与细胞的不对称分裂，是芽胞形成中不可或缺的重要蛋白[4]。

炭疽芽胞杆菌中FtsE蛋白的功能还不清楚，因此，我们构建了炭疽芽胞杆菌ftsE基因的原核表达质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了融合表达。因为外源表达的可溶性蛋白具有易分离、活性高、与体内状态更接近的特点，我们摸索了FtsE蛋白的可溶性诱导表达条件，并利用Pharmacia公司的FPLC及Ni-NTA对表达产物进行了纯化，获得了纯度达90%以上的融合蛋白，为下一步抗体制备及其体内外功能的研究奠定了基础。

图3 重组蛋白的诱导表达（左）及Western印迹（右）

图4 纯化洗脱FtsE蛋白的SDS-PAGE

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