大肠杆菌L-色氨酸合成的代谢流分析

申彤，徐庆阳，张成林，谢希贤

1.天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046

L-色氨酸是人体必需的氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料工业等领域，但因目前生产成本较高，限制了其应用规模。近年来，随着市场需求的加大，色氨酸的生产规模不断扩大，对生产菌株的要求也越来越高。应用重组DNA技术和相关的遗传学手段进行有精确目标的基因操作，这一代谢工程新思路已在色氨酸生产菌中得到广泛应用，大大提高了色氨酸的发酵产酸水平，其育种的高度定向性也大大改善了过去诱变育种的盲目性[1]。代谢流分析（metabolic flux analysis，MFA）是对代谢途径流量进行测定分析的方法[2]。近年来，人们通过代谢工程方法改变细胞内部的代谢流分布，使其生成更多的目的产物。代谢流分析成为代谢工程中用以指导遗传操作的理论基础，是代谢网络分析的基本方法[3]。

为了使大肠杆菌中心代谢流能更多地进入色氨酸合成的代谢途径，我们用基因重组技术构建了转酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）过表达质粒pEML03[4]，增加色氨酸前体物质4-磷酸赤藓糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的浓度，从而提高色氨酸产量。利用Red重组技术敲除贮碳因子基因（csrA），增加色氨酸前体物质PEP的供应量，并在原菌株和敲除csrA基因的菌株中分别转入pEML03，再对上述菌株进行30 L分批发酵试验，考察基因重组对色氨酸发酵过程的影响。通过测定在拟稳态下主要代谢物浓度的变化速率，得到了原菌株和重组菌株L-色氨酸合成的代谢流量分布图，通过对主要路径和关键节点的代谢流分析，阐述了基因操作对L-色氨酸合成代谢流的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

L-色氨酸生产菌TRTH0709（E.coliK12 ΔcsmΔtrpRΔtna/pSV-709）、TRTH1013（TRTH0709含有tktA和ppsA共表达质粒pEML03）、TRTH1105（TRTH0709ΔcsrA）、TRTH1107（TRTH1105含有质粒pEML03）由天津科技大学代谢工程研究室保藏。种子培养基和发酵培养基见参考文献[5]。酵母粉、蛋白胨（OXOID公司）；Na2SO4、CuSO4·7H2O等其他培养基试剂（天津市北方天医化学试剂厂）；色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸等（Sigma公司）；2，4-二硝基氟苯（天津德宇生物技术公司）；5 L、30 L发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）；氨基酸专用色谱柱（C18，5 μm，250 mm× 4.6 mm，No.20200031）。

1.2 摇瓶及发酵罐培养

[5]。

1.3 分析方法

菌体生物量、菌体比生长速率μ、葡萄糖浓度、L-色氨酸含量测定见参考文献[5]；氨基酸的检测见参考文献[6]。

2 结果与讨论

2.1 L-色氨酸发酵过程曲线

发酵过程中每隔2 h取样测定菌体的生物量、葡萄糖消耗量及L-色氨酸的生成量。整个发酵过程中以上参数的变化情况曲线见图1，可以看出TRTH1013在生长早期，生长速度略低于出发菌，但在中后期能维持较高生长速度，最高生物量与TRTH0709相比仅低1.8%，最终色氨酸的产量达到40.2 g/L，增长幅度为11.9%。TRTH1105在对数期与原菌株生长速度几乎一致，到达稳定期后菌体增速大于原菌株，最高菌体量达到49.0 g/L，比原菌株提高2.9%，色氨酸产量为37.7 g/L，与原始菌株相比提高了5%。TRTH1107的最大生物量为48.5%，比原菌株提高1.9%，色氨酸最终积累量为41.2 g/L，比原菌株提高了15.1%。

从图1还可看出，发酵进入26 h后，菌体数量基本不再增长，色氨酸在26～28 h期间处于高速增长期，同期耗糖速度也较快。将这段时间假设为拟稳态，细胞生长速度为零，胞内代谢物浓度变化为零。

2.2 重组菌株与出发菌株的代谢流分析比较

图1 出发菌株和重组菌株的分批发酵试验

据文献报道[7-10]，大肠杆菌的代谢网络包括糖酵解（EMP）、三羧酸（TCA）循环、磷酸戊糖（HMP）途径、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）催化的回补途径、磷酸转移酶系统（PTS）及乙酸、乳酸等代谢副产物的积累。因发酵控制采用零残糖流加工艺，在进入稳定期后，几乎无溢流代谢物乙酸、乳酸的积累，因此不考虑乙酸、乳酸的生成途径。本研究所用菌种为苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，因此代谢途径中不考虑苯丙氨酸和酪氨酸合成支路。结合上述分析，建立代谢网络。分别测定并计算拟稳态时期26～28 h的葡萄糖消耗速率、色氨酸生成速率及发酵液中能够检测到的丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和组氨酸的浓度变化速率（表1），分别转换成摩尔流量后，以葡萄糖的代谢流为100进行标准化处理，用MATLAB软件计算代谢流分布。初步计算表明各供试菌株在色氨酸发酵中后期由中心代谢途径r8提供的NADPH已完全能够满足氨基酸合成的需要，G6P到Ru5P的反应是不可逆反应，r10的计算结果均为负值，不符合代谢的生化热力学。在这种情况下r10的反应被关闭[11-12]，因此设定r10为零，在代谢流计算时也不考虑NADPH节点处的反应平衡式。在此前提下，建立的方程组包括20个方程、26个未知数，自由度为6，根据已知参数用MATLAB软件计算，实际代谢流分布如图2所示。

代谢流分析结果表明，过表达tktA和ppsA（TRTH1103），使EMP（r3）途径代谢流减少1.6%，HMP（r11）途径增加9.6%，TCA循环（r8，r9）减少了7.0%，最终使色氨酸生成途径代谢流增加了13.3%。敲除csrA基因（TRTH1105），EMP途径代谢流几乎未变，HMP途径增加1.3%，TCA循环增加了1.4%，最终使色氨酸生成途径代谢流增加了2.1%。在csrA基因敲除菌中转入tktA和ppsA过表达质粒（TRTH1107），使EMP途径代谢流减少4.0%，HMP途径增加13.6%，TCA循环减少了8.0%，最终使色氨酸生成途径代谢流增加了15.7%。从以上分析数据可以看出，ppsA和tktA分别对PEP和E4P的生成起关键作用，2种基因的共同表达能显著影响中心代谢流，使其转向色氨酸的生成途径。敲除csrA基因，会对直接或间接参与PEP代谢的若干酶产生影响，导致细胞内PEP水平提高[13]。以往研究指出[14]，仅凭借PEP胞内浓度的增加对色氨酸产量不会有太大影响，需要同时使色氨酸合成的另一个重要的限制性底物E4P的浓度与PEP相平衡，才能进一步提高色氨酸合成。而tktA和ppsA过表达质粒的转入令PEP和E4P的浓度同时增加，PEP除了与E4P一起进入色氨酸合成途径外，还会分流转化为PYR，进入TCA循环或通过PEP羧化酶催化合成草酰乙酸，并且主要参与PTS葡萄糖的运输。与PEP相比，E4P没有竞争途径分流。所以，2个前体物质中PEP可能存在供应不足的问题，csrA基因的敲除会进一步补充PEP的供应量。从TRTH1107的代谢流分析可以看出，2种遗传标记的叠加使色氨酸代谢流进一步增加，达到了15.7%。

表1 代谢产物变化速率（26～28 h）（P＜0.05）

图2 出发菌株和重组菌株色氨酸合成的代谢流分布

从连接中心代谢途径和色氨酸生成途径的关键节点PEP处的流量分配可以看出，PEP生成OAA的流量，tktA和ppsA过表达菌减少了20%，csrA基因的敲除菌减少了33%，二者标记叠加后减少了47%；由PYR生成PEP的量，3株重组菌分别增加了58%、6.5%和70%。同样说明tktA和ppsA过表达显著加强了PYR逆转生成PEP的流量，单纯敲除csrA基因对流量的影响较小，但在tktA过表达的情况下可以明显加大由PYR生成PEP的流量。以上2项流量分配的变化，有力地促进了PEP进入色氨酸合成途径的代谢流量。另外，从副产物氨基酸的流量变化的逐渐降低，也可证实tktA、ppsA的过表达和csrA的敲除对出发菌株的色氨酸基因改造是成功的。

3 结论

综合以上代谢流的分析结果可以看出，针对大肠杆菌中心代谢途径的基因操作，tktA和ppsA的过表达、csrA的敲除，以及二者的叠加，均能有效改变中心代谢途径的流量，并增加L-色氨酸生成的代谢流。但tktA和ppsA过表达的影响更为显著，虽然csrA的敲除对各代谢途径影响不大，但可以适当补充因分流而造成的PEP的不足，在质粒pEML03存在的情况下能显著增加L-色氨酸生成的代谢流。从各副产物的流量分析也可以看出仍有继续使其降低的必要。另外，葡萄糖转运系统（PTS）消耗了大量PEP，因此对ATP的需求较大使TCA循环的代谢流比例较大，碳代谢流主要消耗在TCA循环，使色氨酸生成途径的碳代谢流偏低，寻求不消耗PEP的转运系统代替PTS，能够较好地解决这个问题。

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