人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化

丁红梅，赵强，王玮，李慧，刘农乐，李洁，苏雪婷，黄皑雪，房涛，李少华，邵宁生

1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850；2.武警后勤学院 生物化学与分子生物学教研室，天津 300162

人vasorin（VASN）蛋白在果蝇中的同源蛋白又称为SLIT-like 2（SLITL2），关于该蛋白的研究报道相对较少。正常情况下，VASN蛋白主要在大动脉的血管平滑肌细胞表面强表达，部分脱落成为分泌型；VASN mRNA在肾脏和胎盘中少量表达，在其他正常组织如心、脑、结肠、胸腺、肝脏等中微弱表达[1]。

研究发现，VASN能够参与中枢神经系统和血管形成[1-2]，主要通过下调TGF-β参与损伤血管的应答反应，最终影响血管壁的形成。VASN蛋白能够结合TGF-β，减弱TGF-β的信号传导，吸引血管内皮细胞的迁移和诱导其形成血管样结构，并抑制白细胞的迁移[2]。

TGF-β与肿瘤发生、发展密切相关，在调节肿瘤细胞的增殖和分化、抑制机体免疫功能、增加血管生成、诱导细胞外基质的产生而促进肿瘤的侵袭和转移中均具有重要作用。而在肿瘤的发展过程中，肿瘤诱导的新生血管形成、肿瘤细胞和内皮细胞之间的“通讯”一直被认为是最重要的。因而，VASN与TGF-β通路、肿瘤的关系引起我们的关注[5]。

生物信息学分析发现，VASN蛋白是一种典型的Ⅰ型膜蛋白，含有串联的富含亮氨酸（LRR）结构域、表皮生长因子（EGF）样结构域和纤连蛋白Ⅲ（FN3）结构域，而其他含有这些结构域的细胞外基质蛋白和黏附分子通常都具有多个结合分子，通过多条通路发挥生物学功能[3]。此外，该蛋白名称的来源蛋白——SLIT蛋白家族成员（包括1、2、3），同样在细胞膜表面和细胞外分泌表达，同样在神经轴突形成和血管形成中具有重要作用，且尽管与VASN/SLITL2蛋白一级序列的同源性并不高，但同样含有串联的LRR、EGF样结构域，另外还有层粘连蛋白G样模件，近年来多篇报道认为SLIT蛋白在多种实体瘤中表达，并与肿瘤的恶性程度相关，是抑制肿瘤细胞侵袭的重要靶分子，其机制可能是通过内皮细胞表面的受体Roundabout（Robo）介导的信号通路促进新生血管形成、促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡抑制白细胞迁移等[4]。因此，VASN与TGF-β通路、肿瘤的关系也是我们实验室的研究方向。

由于有关VASN的研究报道较少，且没有商品化VASN标准品出售，因此，表达、纯化VASN蛋白对于深入研究该蛋白的生物学功能具有重要意义。我们运用PCR技术，从人肝癌细胞株HepG2的cDNA中扩增获得VASN基因，将其克隆至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3）并进行诱导表达，利用载体上的His标签纯化了融合蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞HepG2购自上海细胞库；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株，原核表达载体pET28a均由本室保存；高效克隆PCR产物专用载体pMD18T购自TaKaRa公司；Ni2+金属螯合层析柱购自GE公司；限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Promega公司；兔抗人VASN单克隆抗体购自Abnova公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自Santa Gruz公司；TRIzol试剂为Invit⁃rogen公司产品；通用引物oligo-dT由上海生工公司合成；其他化学试剂均为分析纯产品。

1.2 cDNA的获得

用TRIzol法提取HepG2细胞总RNA。取总RNA 1 μg、oligo-dT 0.5 μg，用DEPC水补足5 μL，70℃变性5 min后，加入M-MLV逆转录缓冲液4 μL、25 mmol/L MgCl22.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.4 μL、DEPC水6.7 μL、40 U/μL核糖核酸酶抑制剂0.5 μL、M-MLV逆转录酶1 μL组成20 μL体系，42℃反应1 h后70℃处理15 min以灭活逆转录酶，制备的cDNA保存于-20备用。

1.3 目的基因的扩增及鉴定

引 物 P1（3'-gggaattccatatgtgcccatccggctgccagt-5'）和 P2（5'-ccggaattcgagcggcaggttgccctcgc-3'）各100 ng、cDNA 10 ng，按常规PCR步骤加入Taq酶、dNTP、1×Taq酶缓冲液，用ddH2O补至100 μL体系，运行PCR程序（95℃ 10 min，94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，30个循环，末次循环后延伸10 min）。对PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定并分析，确定获得扩增产物片段。将PCR产物进行切胶回收、纯化，获得目的基因片段。将目的基因片段与高效克隆PCR产物专用载体pMD18-T连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆测序，获得重组质粒pMD18-T-VASN。引物合成及测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 重组表达质粒的构建及鉴定

对测序正确的阳性质粒pMD18-T-VASN进行质粒的提取，详细步骤参照小量质粒提取试剂盒操作说明书。提取的质粒用限制性核酸内切酶NdeⅠ/EcoRⅠ双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；用NdeⅠ/EcoRⅠ双酶切大肠杆菌表达载体pET28a，回收载体片段；将上述酶切片段于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，培养后挑取克隆接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃摇床上振荡培养过夜；收集菌液提取质粒，以质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR鉴定及NdeⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 目的蛋白的诱导表达

将转化有pET28a-VASN表达质粒的大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-VASN于37℃培养过夜，然后按照1∶100的比例扩大培养，37℃、200 r/min振荡培养至细菌D600nm值为0.6以上时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L,37℃条件下继续振摇6 h，离心收集菌体，制备电泳样品，行10%的SDS-PAGE，对转化有pET28a对照质粒的大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a做同样处理。

1.6 目的蛋白的表达形式分析及纯化

将电泳鉴定正确的阳性菌液进行目的蛋白表达。菌液按1∶100的比例接种振荡培养过夜，次日晨继续按1∶100转接入400 mL LB培养基中，待细菌D600nm值为1.0时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，诱导表达6 h；4℃条件下收集菌体，将菌体沉淀悬浮于1×PBS液中，置冰上超声波破碎菌体（超声功率400 W，超声10 s间隔20 s，时间30 min），4℃离心，取上清与沉淀分别进行SDS-PAGE，以确定目的蛋白是否存在可溶性表达。采用Ni2+金属螯合层析柱纯化目的蛋白，按照GE公司操作手册进行。

1.7 目的蛋白的Western印迹鉴定

将诱导后的菌体总蛋白，及诱导后的菌体超声波沉淀和上清行SDS-PAGE，以兔抗人VASN兔单克隆抗体（1∶300）为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG（1∶8000）为二抗，行Western印迹鉴定。

2 结果

2.1 VASN基因的克隆及鉴定

以肝癌细胞HepaG2的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段，1%琼脂糖电泳分析表明，扩增的片段与预期1667 bp大小一致（图1）。将PCR产物纯化后克隆至高效克隆载体pMD18-T中，随机挑取4个克隆，以菌液为模板行PCR扩增鉴定，电泳结果发现1～3号菌液的结果与预期一致（图2）。将1号菌液送交公司测序，序列结果分析比对证明扩增的目的基因胞外区片段序列及读框正确。

2.2 pET28a-VASN表达载体的构建

选取测序结果正确的克隆，提取质粒，NdeⅠ/EcoRⅠ酶切回收目的片段，与经相同酶切的表达载体pET28a连接，连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组表达质粒pET28a-VASN。随机挑取5个克隆，以菌液为模板行PCR扩增鉴定，电泳结果发现1、4、5号菌液的结果与预期一致，基因片段长度约为1700 bp（图3）。将1号菌液送交公司测序，序列结果分析比对证明扩增的目的基因片段序列及读框正确，表明目的基因已正确克隆入pET28a表达载体。

2.3 重组蛋白VASN的诱导表达及鉴定

重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET28a-VASN 经IPTG诱导表达后，进行10%的SDS-PAGE分析。结果表明，相对蛋白分子质量约61×103处有一条较为明显的特异蛋白条带，与预期一致，且在D600nm值为0.8时诱导的相对表达量高（图4）。将诱导表达菌体经超声波破碎后离心，将上清与沉淀分别进行SDSPAGE，发现目的蛋白主要集中于包涵体中（图5）。为了进一步确证表达的目的蛋白及表达形式，将菌体总蛋白、超声波上清及包涵体经10%SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，Western印迹鉴定表达的蛋白及存在形式，结果表明诱导的蛋白被VASN单抗特异识别，且仅在包涵体中存在，上清中检测不到目的蛋白（图6）。

图1 VASN cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定

图2 pMD18-T-VASN克隆的PCR鉴定

图3 重组质粒pET28a-VASN的PCR鉴定结果

图4 不同菌液D600nm值条件下IPTG诱导目的蛋白表达的实验结果

图5 目的蛋白表达的SDS-PAGE结果

2.4 重组VASN蛋白的纯化

目的蛋白经超声波破碎后，离心收集菌体，经0.5%Tween-20漂洗2次，用8 mol/L尿素溶解包涵体，经0.45 μm膜过滤，过Ni2+金属螯合柱进行纯化，采用0～100 mmol/L咪唑梯度洗脱目的蛋白，电泳结果表明目的蛋白得到了较好的纯化（图7）。

图6 表达产物的Western印迹

图7 目的蛋白的Ni2+柱纯化结果

3 讨论

VASN是Ⅰ型跨膜蛋白，一次跨膜，多肽链的N端在胞外，C端在胞内。VASN由673个氨基酸残基组成，预期相对分子质量为74×103。据报道，VASN在人肺癌细胞株A549及仓鼠卵巢癌细胞株CHO中高表达[6]。研究发现，在肺癌细胞中，ADAM17通过调节VASN的水平控制TGF-β介导的上皮间叶细胞转化（EMT），临床试验也证实抑制ADAM17能够抗肿瘤[7]，可以作为靶标应用于临床，成为早期控制肿瘤发展的有效手段。目前的研究主要证明膜型表达的VASN在ADAM17的调控下剪切脱落为分泌型蛋白，分泌型蛋白通过与TGF-β结合并减弱TGF-β信号来发挥调节血管及神经突起形态发生过程[1-3]。VASN胞外区的LRR、EGF样和FN3结构域通常都具有多个结合分子，因此推测可能还通过多条通路发挥其他生物学功能[8]。因此，表达、纯化VASN蛋白的胞外区具有重要意义。我们通过构建VASN胞外区重组表达质粒，转化大肠杆菌，在IPTG诱导下获得了重组目的蛋白，并初步进行了Ni2+柱纯化，获得了纯度为90%的目的蛋白。经过多种条件探讨，包括诱导剂浓度、诱导温度、菌体吸光度值等，均发现目的蛋白以包涵体形式存在。获得具有生物学活性的VASN蛋白，对于肝癌的发生发展机制研究具有一定的意义。后续工作仍需要对其进行相关生物学活性检测，目前这一部分工作仍在进行中。

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