用于病毒研究的人源化小鼠研究进展

乔卿华，韩佩君 综述；汪爱勤，尹文 审校

第四军医大学 基础部微生物学教研室，陕西 西安 710032

人源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用作人类疾病体内（in vivo）研究的活体替代模型。人源化小鼠模型的应用很广泛，在艾滋病、癌症、传染病、人类退化性疾病、血液病等研究领域都有广泛的应用。病原体感染人源化小鼠模型后，可以在小鼠体内扩散到不同器官系统，并在细胞和整体水平引起相应的反应，使我们能够研究对应的人类免疫反应和相关免疫病理机制[1-3]。过去的25年里，在创建和开发用于传染性疾病研究的人源化小鼠领域已经取得了很大进展[1-5]。人源化小鼠已被用于人类病原体如人免疫缺陷病毒（HIV）、Epstein-Barr病毒（EBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和登革病毒（dengue virus，DENV）等的研究。我们介绍几种有代表性的人源化小鼠模型及其在病毒研究中的应用。

1 人源化小鼠模型概况

各种人体细胞和组织移植到不同品系的免疫缺陷小鼠体内创建出不同类型的人源化小鼠模型，它们有各自的优缺点，根据实验需要选择不同的模型。新型人源化小鼠模型与以往模型的一个主要的进步是它们能够产生初次免疫应答。表1总结描述了这些模型的特点和异同。

1.1 hu-PBL小鼠

hu-PBL（human peripheral blood lymphocytes）小鼠早期由人成熟外周单个核细胞经腹腔注射入重度联合免疫缺陷（severe combined immunodeficien⁃cy，SCID）小鼠构建而成[4]。目前该小鼠模型常采用NSG（NOD SCID IL-2R γc-/-）或 RG（BALB/c Rag2-/-IL-2R γc-/-）小鼠，移植效果更好。人体免疫细胞在移植后可存活数个星期，并且能在一定程度上发挥效应。它们可以被嗜血细胞病毒如HIV-1等有效感染。该小鼠模型受抗原刺激后人类记忆性B细胞仍能产生抗体，然而因不能重启多向造血功能无法产生初次免疫应答。另外，T细胞的注入可产生移植物抗宿主病（graft versus host dis⁃ease，GVHD），但适合研究异种移植的GVHD[6]。

1.2 hu-HSC小鼠

hu-HSC小鼠是通过不同路径将造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）移植入不同的免疫缺陷小鼠体内构建而成。多年来，hu-HSC小鼠模型已得到极大发展。目前常用的hu-HSC小鼠有2种，早期模型主要通过静脉或股动脉注射方式将CD34+造血祖细胞植入合适的成熟NOD-SCID小鼠，可重建淋巴细胞增殖，但T细胞发育不良；新模型采用NSG、RG 或 NOG（NOD/Shi-SCID IL-2R γc-/-）小鼠，可使人体细胞更好地定植，能够产生全系T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞[2,6]。CD34+HSC可来源于脐血、骨髓、胎肝或经外周血诱导，其中胎肝来源的HSC定植效率更高，持续时间更长，选用出生3 d的新生小鼠比成年小鼠移植效果更好。

表1 不同类型人源化小鼠模型比较

1.3 SCID-hu小鼠

SCID-hu小鼠是通过外科手术在SCID小鼠肾包膜下联合植入人胚胎胸腺和肝脏（包含造血干细胞）组织片段，从而构建具有人类胸腺（胸腺/肝脏样细胞团）功能的小鼠[7]。这些有活性的胸腺组织可以产生人胸腺细胞和初始T细胞，成熟T细胞局限于胸腺/肝脏样细胞团周围使外周T细胞数量减少。该模型因免疫细胞缺陷而无法产生人类免疫反应，但有助于研究HIV和人嗜T细胞病毒（HTLV）等病毒的关键发病机理，并为创建新的和持续改进现有的人源化小鼠模型奠定了基础[5]。SCID-hu小鼠的缺点，一是需要外科手术，操作难度大，不易获得；二是植入胚胎组织后，要经过数月时间才能检测到嵌合体的形成；三是人的胚胎组织获取较困难，应用中有伦理道德阻碍。

1.4 BLT小鼠

BLT（bone marrow-liver-thymus）小鼠是在辐照过的免疫缺陷小鼠肾包膜下联合植入人类胎肝和胸腺组织，同时静脉注射相同胎肝来源的造血干细胞构建而成。早期BLT小鼠用NOD-SCID小鼠构建，目前多采用NSG、NOG或RG小鼠[8]。BLT小鼠与SCID-hu小鼠模型的主要区别在于相同胎肝来源的造血干细胞的额外重建[9]，虽然只是对SCID-hu小鼠模型的轻微修改，却有明显改进，由于同源人类胸腺的存在，可产生T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞及适当的人类T细胞训育和限制性，可以针对病原体产生特异性体液免疫和细胞免疫反应。BLT小鼠模型可以形成人类黏膜免疫系统，可用于研究HIV的黏膜感染机制。

2 人源化小鼠的免疫反应

2.1 人源化小鼠的体液免疫反应

hu-HSC小鼠能够对抗原产生特异性人类IgM和IgG型免疫反应，以IgM型抗体反应为主，抗原特异性IgG反应弱，提示免疫球蛋白类别转换缺陷。Watanabe等[10]的研究认为免疫球蛋白类别转换不足不是源于B细胞内在缺陷，而是因为T细胞协同障碍。hu-HSC小鼠对于抗体产生和类别转换上的巨大差异可归因于诸多因素，包括缺乏适当的人类T细胞限制性和辅助，以及实验方案的不同，例如使用新生小鼠相对于成熟小鼠来进行HSC移植、使用不同来源的HSC（脐血或胎肝），因此hu-HSC小鼠也有必要进一步改进。传统的SCID-hu小鼠被进一步改进成BLT小鼠，由此提供了一个对于人T细胞发育和改善T/B细胞协同作用更适合的胸腺微环境[9,11]，因此，除B细胞、巨噬细胞和树突状细胞增殖外，T细胞也能良好增殖发育。在T细胞成熟过程中阳性选择和阴性选择应在其自体人源胸腺中发生，BLT小鼠体内的T细胞可以产生MHCⅠ和Ⅱ类限制性免疫反应并提供T细胞辅助抗原刺激B细胞[11-12]。许多早期研究表明，在BLT小鼠体内同时有IgM和IgG型抗原特异性反应，但强度不同[2,11]。随后Rajesh等[13]研究表明，尽管反复增强免疫也不会发生抗原特异性IgG反应，这是因为缺乏生发中心形成和免疫球蛋白类别转换的最佳条件。Biswas等[14]关于BLT小鼠的深度研究发现了经HIV-1和西尼罗病毒包膜抗原免疫后发生的特异性抗体反应，但其B细胞组成和抗体反应都同健康人有显著区别，该IgG抗体的特点是即使反复增强免疫也不能产生再次应答。

2.2 人源化小鼠的人类T细胞免疫反应和HLA限制性

早期研究表明新型hu-HSC小鼠可以针对多种人类病原体产生抗原特异性T细胞反应[2]。hu-HSC小鼠感染HIV-1或EBV后，CD8+T细胞消耗，使感染不能得到有效控制，同时也证明了T细胞在免疫保护中的作用[15]，但 Baenziger[16]和Watanabe等[10]的研究显示，在hu-HSC小鼠体内存在T细胞反应缺陷。重新刺激HIV-1和EBV感染的小鼠细胞，采用体外细胞因子分泌实验、细胞增殖实验和细胞毒性实验，均可检测到特异性CD4和CD8反应，但反应强度很低。这可能由多个因素造成。首先，是由于此种小鼠全身T细胞水平较低，这种降低有可能是由于其他原因造成的潜在的淋巴细胞减少后所诱导的T细胞活化，而此途径所诱导产生的T细胞数量较少[17]；第二，hu-HSC小鼠较低的人类T细胞水平可能是由于缺少人类T细胞的白细胞抗原（HLA）限制。这是因为T细胞的选择是发生在异源小鼠胸腺环境中，用H-2限制代替了HLA限制，导致不能有效地进行阳性选择，从而减少了人类的T细胞的产生数量；第三，小鼠抗原呈递细胞（APC）和人类T细胞之间相互作用在小鼠胸腺和外周环境中的降低，将造成信号减弱，并将减少胸腺中T细胞的产出率和外周环境中人类T细胞的存活数量，这些最终使得初始T细胞的数量减少[17]。最近Danner等[18]指出，当RG小鼠用匹配的HLA-DR4 CD34+脐血细胞进行HLADR4转基因，其胸腺和外周T细胞急剧增多。Shultz等[19]创建了HLA-A2Ⅰ类转基因小鼠，并使用匹配的HSC进行重建，这些小鼠被证明能够对EBV产生HLA限制性细胞免疫反应。BLT小鼠的T细胞反应正常是因为使用同源人类胸腺和HSC重建，产生T细胞反应的HLA限制性和更高效的T细胞和B细胞相互作用。Dudek等[20]的研究表明，HIV感染BLT小鼠催生Ⅰ类限制性抗原表位特异性抗病毒反应，发现了在特异性、动力学和免疫显性方面与人体相似的抗原特异性CD8+T细胞反应，同样发现了小鼠表达的HLA类等位基因HLA-B57表现出对HIV-1感染的增强控制，该等位基因在人体内承担同样作用。

3 人源化小鼠在病毒研究领域的应用

人源化小鼠已被用于研究多种人类病原体，特别是病毒，其中在HIV-1、EBV、HCV和登革病毒研究中的应用最为广泛。

3.1 人免疫缺陷病毒

HIV-1是一种反转录病毒，能够特异性感染人类免疫系统。体内存在HIV-1易感细胞的人源化小鼠为HIV-1研究提供了一个很好的体内实验模型。一些早期研究采用hu-PBL和SCID-hu小鼠模型，获得了珍贵的数据资料[4-5]。但这些模型的主要缺点是人类免疫细胞谱系和免疫系统功能不全，因此限制了在疾病中起核心作用的免疫发病机理的研究。使用RG、NOG和NSG小鼠构建的新型人源化小鼠在一定程度上纠正了这些缺陷[2-3,21]。嗜CCR5、嗜CX⁃CR4和双嗜性病毒能够稳定感染小鼠模型，且有典型的辅助性CD4+T细胞消耗，这是HIV-1感染免疫抑制的标志。与在人体内一样，嗜CCR5病毒优先消耗CD45 RA CD4+记忆性T细胞，而嗜CXCR4病毒则快速消耗CD45 RA+初始T细胞和CD45 RACD4+记忆性T细胞[2]。

除了CD4+T细胞消耗外，许多其他HIV发病机制也被提出[22-23]，包括肠道完整性破坏使微生物易位造成的慢性免疫功能激活、调节性T细胞（regulato⁃ry T cells，Treg）损失、浆细胞样树突状细胞（plasma⁃cytoid dendritic cells，pDC）激活和Ⅰ型干扰素生成等。在HIV-1感染hu-HSC RG小鼠时pDC激活导致Ⅰ型干扰素和其他细胞因子生成已被证实。这也与免疫激活和辅助性CD4+T细胞消耗呈正相关。使用NSG-BLT小鼠的研究还显示IFN-α浓度升高和免疫激活[24]。慢性HIV-1感染时，程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）上调使T细胞枯竭被认为在降低T细胞功能方面起重要作用。HIV-1感染人源化小鼠时PD-1的上调与感染人类时相似，因此使用该系统可以进行新的抑制性靶点的治疗策略研究。Palmer等[25]对HIV-1慢性感染的hu-HSC RG小鼠给予PD-L1单克隆抗体和PD-1配体，可以抑制病毒复制，降低病毒载量并提高T细胞水平。

众所周知，HIV-1感染有潜伏期，潜伏感染的细胞充当了病毒贮存库，甚至在进行高效抗反转录病毒 治 疗 （highly active antiretroviral therapy，HAART）期间亦如此。被病毒潜伏感染的细胞无法被免疫系统识别，也不受HAART的影响。停止HAART导致病毒反弹。当前的治疗策略是旨在消除潜伏感染的细胞以达到完全治愈[26]，因此，一个能够模拟HIV人体潜伏感染的体内试验系统的价值将是无法估量的。为此，已有3项研究利用人源化小鼠构建了HIV-1潜伏感染模型[27-29]。利用RG小鼠模型，Choudhary等[27]发现HAART可以将HIV-1载量抑制至检测不到的水平，但停止治疗后病毒载量发生反弹。来自体内的刺激后，在休眠的CD4+T细胞内可发现潜伏感染的病毒。使用BLT小鼠进行的类似实验也在休眠CD4+T细胞内发现了潜伏感染的病毒。总之，HAART可以将病毒抑制至无法检测的水平，虽然停止治疗后病毒载量反弹，但能将潜伏感染病毒诱导至有效感染，该新型人源化小鼠模型提供了一个比较理想的体内试验系统，以能够用来研究潜伏感染HIV的清除。

3.2 EB病毒

EBV是一种广泛传播并导致长期感染的疱疹病毒，全球超过90%的人口感染过EBV。人类是该病毒的主要自然宿主，初次感染后可潜伏终生。EBV可引起急性单核细胞增多症、淋巴增生性疾病（lym⁃phoproliferative disease，LPD），以及多种恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤等。大多数感染者的免疫系统通过效应性T细胞控制感染，抑制恶性肿瘤的发生。病毒感染后，有超过80个病毒基因表达，但肿瘤细胞只表达8个潜伏相关病毒蛋白，即6个核抗原（EBNA）和2个膜蛋白（LMP1、LMP2）[30]。根据这些蛋白表达的不同，可将EBV感染分为几类：①潜伏Ⅰ型，仅表达EBNA1，见于EBV阳性的Burkitt淋巴瘤；②潜伏Ⅱ型，表达EBNA1、LMP1和/或LMP2，见于EBV阳性的霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、周围型NK/T细胞淋巴瘤和其他一些B细胞淋巴瘤；③潜伏Ⅲ型，可表达全部8种EBV潜伏蛋白，见于HIV或器官移植等免疫功能低下的患者发生癌症时。不同个体的EBV感染类型不同，发病机理也比较复杂。可以利用人源化小鼠来评估EBV的感染和免疫反应[30]。早期研究使用人HSC移植入NOD-SCID小鼠并注入EBV形成感染和LPD，表达潜伏蛋白，属潜伏Ⅲ型。然而，该模型不能产生足够数量的人类T细胞，无法研究细胞免疫应答反应。具有较好的人体细胞定植和T细胞生成的hu-HSC RG小鼠能够更好地形成EBV感染模型和更有效的免疫反应。EBV感染后病毒扩增导致CD8+T细胞增殖，产生T细胞反应[31]。感染小鼠体内诱发生成的T细胞经体外培养，在自体淋巴母细胞样细胞系的刺激下产生IFN-γ，使用NSG和BLT小鼠也可得到相似结果。NSG小鼠的EBV感染遵循一个剂量依赖效应[30]，低剂量感染可引发持续无症状感染和可检测的T细胞反应，而中高剂量的病毒感染则造成更强的T细胞增殖，更高剂量的病毒感染可导致肿瘤发生。增殖的T细胞主要是具有保护作用的记忆性T细胞，因为感染前T细胞的消耗导致了更快速和广泛的LPD。基于该模型在感染和免疫反应方面的效用，利用NSG小鼠还进行了EBV突变体研究。EBNA3B基因敲除的突变EBV可形成更强的B细胞增殖，造成类似弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphomas，DLBCL）的淋巴瘤[32]。

3.3 丙型肝炎病毒

HCV属于黄病毒科肝炎病毒属，是RNA病毒，约80%的感染者可形成慢性肝炎，部分病人可发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。慢性HCV感染与CD4+和CD8+T细胞功能受损有关。黑猩猩是公认的最好的HCV感染实验动物，但其成本高昂，属于濒危动物，同时其慢性感染率低且不会发生肝纤维化。因此，一个成本低廉并能发生相应免疫应答的小动物模型对HCV的研究将大有帮助[33-34]。事实上，在过去的10年中已有多种人类肝细胞嵌合体小鼠模型被开发出来，包括可被人体肝细胞定植的Alb-uPA-SCID（Alb-urokinase plasminogen activa⁃tor-SCID）小鼠和Fah-RG（Fah-/-Rag2-/-IL-2R γc-/-）小鼠[35-36]。但这些模型缺少人类免疫系统功能，阻碍了免疫发病机理的研究。具有人类肝脏系统功能的免疫活性人源化小鼠克服了这一困难，该模型使用具有RG小鼠背景的AFC8转基因小鼠构建，AFC8小鼠表达细胞凋亡蛋白酶-8和FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP）活性。人类肝脏祖细胞和造血干细胞联合植入AFC8转基因小鼠肝脏中，再用二聚化因子诱导小鼠肝细胞凋亡，可选择性地使人类肝细胞生长，人类造血干细胞定植可使人类免疫细胞群发育，形成AFC8-hu HSC/Hep小鼠（简称Hu-Liver-HSC小鼠）[34]，该模型中定植的人类肝细胞感染HCV并发生特异性T细胞反应。HCV血症可在uPA和Fah小鼠模型（支持＞50%肝细胞移植）中见到，但在AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型中不能发现，这是因为其肝细胞定植水平较低（约15%），因此该模型仍须改进，尽管如此，这仍是HCV动物模型领域取得的重大进展。

3.4 登革病毒

DENV属于黄病毒科RNA病毒，包括4种血清型，即DEN-1～DEN-4。所有血清型的DENV都可以感染人类，造成从亚临床感染到急性发热性登革热的一系列严重疾病，甚至是致命的登革出血热/登革休克综合征（denguehemorrhagicfever/dengue shock syndrome，DHF/DSS）。目前，研究DENV发病机制及免疫机理的主要障碍是缺乏理想的动物模型。尽管灵长类动物可以感染DENV，但缺乏相应的临床表现。人脐血干细胞移植的NOD-SCID小鼠对DENV易感且具有发热、血小板减少等典型症状。然而，这些人类细胞植入模型的一个主要不足是缺乏人类免疫反应，阻碍了免疫机理和疫苗研究。Kuruvilla等[37]利用hu-HSC RG小鼠第一次完成了人类对DENV免疫反应的全面评估。hu-HSC RG小鼠感染DENV后病毒血症可持续21 d并产生IgM和IgG抗体。因抗体类别转换效率低，所有的小鼠都能产生IgM，只有部分小鼠能产生IgG。这也是首次有研究证实人源化小鼠可产生针对人类病原体的中和抗体。Jaiswal等[38]随后的研究将匹配的脐血植入NSG小鼠，感染小鼠体内产生IgM抗体反应，人类T细胞在DENV肽的刺激下产生了IFN-γ和TNF-α，表明同时发生了细胞和体液免疫反应。该研究小组继续使用BLT-NSG小鼠研究发现，除了产生HLAA2限制性T细胞反应外，还发现了IgM型中和抗体。

4 结语

人源化小鼠从起初的人-鼠嵌合体模型到目前具有人体免疫活性的模型已走过了很长的路，但仍有一些局限性需要克服[6]。如免疫缺陷小鼠的残余天然免疫需要辐照和预处理、T细胞增殖不良和B细胞成熟障碍、hu-HSC小鼠模型缺乏人类HLAⅠ和Ⅱ类限制性、BLT小鼠模型缺乏适当水平的HLA抗原提呈细胞、T/B细胞协同不足导致低水平的抗体反应和低效率的免疫球蛋白类别转换、可交叉反应的天然小鼠生长因子和细胞因子不足等。

随着研究的不断深入，这些不足正在被解决和纠正。除了T细胞、B细胞和NK细胞，小鼠巨噬细胞在人源化小鼠异种移植排斥反应中也起作用，表达 信 号 调 节 蛋 白 α（signal regulatory protein α，SIRPα）的小鼠巨噬细胞能够清除不表达其配体CD47的异种移植人类细胞[39]。Strowig等[40]的研究表明，人类SIRPα转基因可以改善人类细胞在小鼠体内重建，反之，通过慢病毒载体使人造血干细胞牢固结合小鼠CD47配体也可提高移植成活率[41]。人类HLA-DR4的转基因表达也可以增加重建鼠T细胞数量，因此HLAⅠ和Ⅱ类基因在双转基因小鼠共同表达有望进一步提高人类T细胞重建、T/B细胞协同/辅助和调节HLA限制性免疫反应[17]。很多小鼠细胞因子和生长因子如GM-CSF、IL-4、M-CSF、IL-7、IL-15和EPO等，很少与人体相对应的因子发生交叉反应，因此导致人类细胞增殖和维持不理想，在小鼠细胞因子基因座上敲入相对应的人体基因，可以克服这些不足。例如，人类促血小板生成素的表达可提高人体细胞移植成活率和HSC生存率[42]，而人类 IL-3、GM-CSF[42]和 M-CSF[43]基因敲入能够改善小鼠骨髓细胞的分化和功能。显然，具有人类免疫活性的人源化小鼠模型在很多方面正不断改进。然而，这些基于细胞因子、生长因子和HLA分子的策略需要联合应用方可达到预期效果。最近，随着人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞技术的建立，再生医学的发展吸引了研究人员的注意，发展自胚胎干细胞和诱导多能干细胞的人工器官和HSC也将得到应用。鉴于这些研究工作的加速进展，在不远的将来，更加理想的人源化小鼠模型将有望成为现实。

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