人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

李淑月，徐小洁，韩聚强，王涛，符静，李玲，冀全博，王宣，杨国锋，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.河北医科大学，河北 石家庄 050017；3.北京军区总医院，北京 100700

Six1（sineoculis homeobox homolog 1）是一种与乳腺癌有关的同源结构域转录因子[1]，其编码基因位于人染色体14q23上。Six1是由一个高度保守的同源异型结构域（homeodomain，HD，61个氨基酸残基）和Six结构域（Six domain，SD，110～115个氨基酸残基）组成的复合结构，该结构与DNA结合的特异性决定了其靶基因的特异性，为脑、耳、眼、肌肉和肾等多种器官发育所必需[2-4]。当Six1调控异常时，不但使胚胎发育和组织器官出现异常形态结构、胚胎死亡，而且在肿瘤发生和转移中发挥关键作用[5]。同时，Six1在44%的早期和90%的转移性乳腺癌中过表达[7]。研究表明，Six1可以通过升高血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的水平来促进肿瘤淋巴管的形成及淋巴转移[1]。我们拟构建Six1的真核表达载体，并验证其升高VEGF-C水平的功能，为进一步探讨Six1与肿瘤的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞、乳腺癌ZR75-1细胞由本室传代培养；pXJ-40-myc载体为本实验室保存；Vigo⁃Fect为威格拉斯生物技术有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂均购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购自Promega公司；DMEM及小牛血清均购自Gibco公司；引物合成由北京赛百盛生物技术公司完成；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 myc-Six1重组质粒的构建与测序

以本实验室保存的乳腺文库为模板，根据Six1的编码序列合成上游引物5'-CGGGATCCATGTCG ATGCTGCCGTCGTTTGGC-3'和下游引物5'-CCC AAGCTTTTAAGCCCGGGAGAGAATAGTTTG-3'，采用PCR扩增人Six1的编码序列（扩增程序：95℃预变性5 min，以95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min进行31个循环，72℃延长7 min），用胶回收试剂盒回收PCR产物。

用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pXJ-40-myc载体，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成带有粘端的双链，用T4DNA连接酶连接入pXJ-40-myc载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，摇菌并提质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.3 哺乳动物细胞转染和Western印迹检测

用含双抗、100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基将293T细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。转染方法参考文献[8]。将4 μL Vigo⁃Fect与200 μL NaCl混合，再将总量为10 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，并以同样方法转染空pXJ-40-myc载体作为对照，37℃、50 mL/L CO2常规培养，4～6 h换液。质粒转染293T细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2×SDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液进行SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的用HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。转染重组质粒和空载体后，用上述方法行Western印迹至5%脱脂奶粉，于4℃封闭过夜后，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的用HRP标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.4 总RNA的提取

用上述转染方法将重组质粒和空载体转染ZR75-1细胞，24 h后弃培养基，用1×PBS洗涤，用1 mL TRIzol溶液吹下细胞，加0.2 mL氯仿提取蛋白混匀，室温放置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量异丙醇混匀，-20℃冷冻10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇（DEPC水稀释）洗1次，4℃、12 000 r/min离心5 min后弃上清，用无水乙醇洗1次，4℃、12 000 r/min离心5 min后弃上清，自然干燥约30 min，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，即为提取的总RNA。

1.5 qRT-PCR检测

按文献方法进行如下实验[9]。取2 μg总RNA，与1 μL 50 μmol/L的随机引物混匀，补水至15.9 μL，70℃解链5 min，自然冷却至室温，加入反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂及反转录缓冲液，剩余补水至终体积25 μL，42℃反应1 h，95℃灭活5 min，得到反转录的cDNA第一链，将其按1∶20稀释，取9.2 μL模板与10 μL SYBR Green Mix（2×）、上下游引物各0.4 μL混匀，进行qRT-PCR，所得数据按2-ΔΔCt公式计算出基因表达的相对量。

2 结果

2.1 myc-Six1重组质粒的构建与鉴定

以实验室保存的乳癌文库为模板，PCR扩增人Six1的编码序列，获得约870 bp的DNA片段，与预期片段大小一致（图1）。将PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，与经同样酶切的pXJ-40-myc载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，进行菌液PCR鉴定，若获得与目的条带750 bp大小接近（图2）的克隆，则初步认为是带有人Six1基因的阳性重组克隆。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，可切出2条长度分别约为5 000和750 bp的条带，而相应的空载体酶切只见大片段，符合预期结果（图3）。DNA序列测序结果表明，插入片段的DNA序列与人Six1基因的编码序列完全一致（数据略）。

2.2 Western印迹检测myc-Six1在293T细胞中的表达

将构建的myc-Six1重组质粒和空载体分别转染293T细胞系，24 h后提取蛋白进行SDS-PAGE，Western印迹检测myc-Six1蛋白的表达。结果显示，转染重组质粒后，用myc-HRP抗体能在相对分子质量约31×103处检测到明显的特异性条带，空载体无条带（图4），说明myc-Six1重组蛋白在293T细胞中能够正确表达。

2.3 myc-Six1在mRNA水平升高VEGF-C

根据文献报道，Six1可通过升高VEGF-C水平来促进乳腺癌淋巴管的形成及淋巴转移[1]。为证明构建的myc-Six1可以上调VEGF-C的表达，我们将myc-Six1和空载体分别转染乳腺癌ZR75-1细胞，收集细胞提取总RNA，行qRT-PCR，引物采用文献报道的序列[6]。结果显示，转染myc-Six1后，ZR75-1细胞中VEGF-C的mRNA水平较转染空载体后明显升高（图5）。

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的主要恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤死亡率的首位。乳腺癌常早期发生淋巴结转移，淋巴结转移的有无及淋巴结受累的程度，是决定乳腺癌分期和临床治疗方案选择的关键，也是临床评估乳腺癌患者病情及预后的重要指标。因此，研究乳腺癌淋巴结转移机制具有重要意义。研究表明，VEGF-C与乳腺癌淋巴管生成和淋巴结转移密切相关。

图1 PCR扩增人Six1的编码序列

图2 重组质粒myc-Six1的菌液PCR结果电泳图谱

图3 重组质粒myc-Six1的BamHⅠ/HindⅢ双酶切电泳图谱

图4 Western印迹检测myc-Six1的表达

图5 qRT-PCR检测Six1对VEGF-C的影响

VEGF-C是VEGF家族的新成员，其基因定位于染色体4q34，主要由肿瘤细胞产生，是较特异的淋巴管生成因子[10]，可以促进淋巴管内皮细胞增生，从而使淋巴管增生或扩张，增大肿瘤淋巴道转移的机会[11]，并增强脉管的通透性，改变淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达，从而促进肿瘤转移[12]。VEGF-C还可诱导新生淋巴管与己存在淋巴管愈合,使肿瘤细胞从新生淋巴管进入淋巴结，发生淋巴结转移，并通过淋巴系统向全身其他器官扩散[13]。

Six1属于同源异型结构域Six家族，在许多恶性肿瘤如乳腺癌[14]、横纹肌肉瘤[15]、肾母细胞瘤[5]等中表达增高。Six1对恶性肿瘤的增殖和转移起到了促进作用[16]，并且能够引起促淋巴生成因子VEGF-C的转录，这对淋巴管生成及淋巴转移也是必需的[1]。

本实验构建的myc-Six1在真核细胞中获得了表达，同时通过qRT-PCR证明了Six1能够在mRNA水平升高VEGF-C。这为进一步研究Six1基因的功能，以及Six1与VEGF-C及乳腺癌转移的关系奠定了基础。

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