端粒酶活性与白内障

王杰 康刚劲

端粒和端粒酶是联结着增殖与衰老的一条纽带。端粒被称为细胞有丝分裂的“生命时钟”，端粒酶的激活与抑制决定着端粒的长度并最终影响细胞的存亡。近年来，大量研究证明，人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)中存在端粒酶活性，其活性改变与白内障的发生、发展密切相关。因此，通过影响端粒酶活性对白内障进行靶向治疗有可能成为白内障防治的新手段。

1 端粒、端粒酶、端粒酶逆转录酶

1.1 端粒 端粒是真核细胞染色体3’末端的非编码DNA序列，它是一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分，在染色体的复制、保护染色体不被核酸降解、防止染色体相互融合和控制细胞生长寿命等方面起重要作用。

1.2 端粒酶 端粒酶是一种逆转录酶，以自身RNA为模板，不断合成新的端粒DNA序列，添加到端粒末端，弥补其在复制中的丢失，解决末端复制问题，维持端粒长度的稳定，赋予细胞无限增殖能力。端粒酶对调节细胞周期、细胞衰老、增殖、转化及肿瘤形成具有重要作用。近年来越来越多的研究发现，其在很多细胞内通路中的作用超过了在端粒长度的维持和复制性衰老方面的作用，这些作用包括调节细胞周期中细胞凋亡、基因表达和DNA损伤应答等［1］。大量研究表明，除眼部肿瘤外，其他眼部增生组织及生长活跃组织亦表达端粒酶活性。LECs与皮肤基底细胞来源于同一胚层，具有相似的性质，一生中处于不断增殖状态以形成晶状体纤维细胞，提示LECs可能具有干细胞特性，其表达端粒酶活性与理论相符合。20世纪末，Colitz等［2］应用端粒重复片段扩增-酶联免疫技术(telomeric repeat amplification-ELISA，TRAP-ELISA)首次对LECs进行了端粒酶的相关研究，发现犬LECs中有端粒酶活性的表达，认为端粒酶活性的失调与白内障的形成密切相关。

1.3 端粒酶逆转录酶 端粒酶由3个亚单位构成—端粒酶RNA成分(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶蛋白1(human telomerase protein1，hTP1)和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)，分别被称为模板、调节亚基、催化亚基。其中hTERT具有逆转录酶活性，在大多数端粒酶阳性的肿瘤和永生化细胞系中hTERT的表达与端粒酶活性呈正相关。hTERT基因转录水平是调节端粒酶活性的重要限速步骤。在体外，仅有hTR与hTERT两种成分就能表达出完整端粒酶活性。

2 端粒酶活性与白内障的关系

白内障病因复杂多样，以往研究多集中在离子失衡、晶状体蛋白改变、氧化应激和免疫反应等方面，近年来在白内障的发生发展过程中观察到端粒酶活性的改变成为又一热点。该领域存在着两大相互矛盾的观点，部分研究者认为白内障LECs中端粒酶活性高于透明晶状体，另有部分研究者的研究结果却表明年龄相关性白内障组LECs中端粒酶活性低于正常组。说明端粒酶在白内障形成过程中的作用机制可能不止一种。目前学者们争论的焦点在于:白内障LECs中端粒酶活性的改变与细胞DNA损伤、增殖的关系，即这种活性的改变是引起白内障的原因还是白内障的继发改变呢?

2.1 端粒酶活性的增加作为白内障形成的继发改变 Colitz等［2］发现白内障组LECs中端粒酶活性及端粒长度明显高于透明晶状体组，且端粒酶活性的表达水平与动物的年龄呈正相关。支持这一论点的学说为:端粒酶的抗凋亡和促修复机制。

大量研究表明，除了维持端粒结构稳定性这一主要作用外，端粒酶还能抑制细胞凋亡［3］。2000年，Xiang等［4］将 hTERT 导入兔 LECs中，hTERT与兔端粒酶模板结合下调p53、Caspase-3水平，上调bcl-2水平，抑制细胞凋亡。Lu等［5］使用端粒酶反义寡核苷酸和聚合酶作为特异性抑制剂转染人肺腺癌A549细胞沉默端粒酶靶基因的表达，结果表明:端粒酶活性受到抑制，且A549细胞的凋亡率明显上升。Korkmaz等［6］发现十水硼酸钠(disodium pentaborate decahydrate，DPD)通过降低hTERT活性从而诱导人前列腺癌DU145细胞的凋亡。端粒酶活性干预凋亡过程，凋亡途径参与端粒酶活性调节。白内障的形成即LECs的衰老和凋亡的过程，随着年龄的增长，体内微环境的改变以及紫外线等电离辐射对LECs损伤的不断积累不可避免地导致LECs发生衰老和凋亡，LECs的衰老和凋亡均不利于晶状体维持其正常的生理功能及透明度，最终形成白内障。在终生具有有丝分裂能力、分裂增殖旺盛的赤道部和旁中央部LECs中可明显检测出端粒酶活性，随着动物年龄的增加端粒酶活性的表达水平上升，表明端粒酶起着对抗LECs的衰老和凋亡的作用。随着白内障的继续进展，端粒酶活性的增加也不足以抵抗端粒缩短时，LECs就会退出细胞循环而进入程序性死亡。

端粒酶在LECs中存在促修复机制。终生具有有丝分裂的旁中央部、赤道部以及静止的中央区LECs中检测到相同水平的端粒酶活性。Sorte等［7］认为，这是由于中央区透明晶状体无虹膜屏蔽，终生都在不断接受以紫外线为主要形式的电离辐射，诱发DNA断裂，染色体损伤，端粒缩短。年龄相关性白内障LECs中存在着DNA氧化损伤。综上，端粒酶活性的表达是对紫外线或氧化应激所致损伤直接或间接的结果。在观察紫外线诱导的人LECs DNA损伤修复过程中端粒酶活性和氧化损伤蛋白的变化时发现紫外线诱导的人LECs DNA损伤修复过程中端粒酶活性上调，其中TERT和hTR水平在紫外线照射的最初24 h升高最为明显［8］。端粒长度的维持与DNA损伤修复机制之间存在着错综复杂的关系，早在2006年，Slijepcevic［9］便提出端粒长度维持与DNA损伤修复的“一体化”模式。Babizhayev等［10］研究表明，端粒在人类LECs形成白内障过程中的缩短速率受到DNA氧化损伤的调控，并且会根据其抗氧化能力的不同而有差异。

LECs中端粒酶的抗凋亡和促修复机制存在很多交叉点，但殊途同归，二者最终通过延缓细胞衰老与凋亡、修复相关损伤在维持LECs的透明性和防治白内障的发生发展中具有不可替代的作用。

2.2 端粒酶活性的改变作为始动因素导致白内障发生 也有实验不支持上述结论，这些实验结果证实端粒酶活性的下降作为始动因素导致了年龄相关性白内障的发生。徐国光等［11］探讨年龄相关性白内障及正常LECs中端粒酶活性的表达时发现年龄相关性白内障组LECs中端粒酶活性明显低于正常组。LECs在体外培养、传代过程中脱离体内微环境，失去了“干细胞”特性，向终末表型分化(由上皮型细胞转变为纤维细胞)，端粒酶活性逐渐丧失，衰老细胞增多，最终发生白内障。Min等［12］在后续研究中采用脱氧核苷酸末端转移酶缺口标记原位细胞检测法以及TRAP-ELISA法检测三个不同年龄组白内障患者LECs的凋亡和端粒酶活性。结果表明随着年龄的增长白内障LECs端粒酶活性逐渐降低，凋亡逐渐增强。从而得出白内障的一个重要发病机制:端粒酶活性的降低促进了LECs的凋亡。

Lü等［13］探讨端粒酶活性在兔后囊膜混浊(posterial capsular opacity，PCO)LECs中的表达时得出结论:白内障术后发生的PCO，是由于赤道部LECs中端粒酶活性的增加作为始动因素使此处的LECs不断增殖并移行至后囊膜分化为成纤维细胞所致。因此，抑制LECs增殖是预防PCO发生的关键。正常后囊膜无LECs，故不应存在端粒酶活性，然而该实验证实该处与赤道部LECs中均存在端粒酶活性，虽然该处活性低于赤道部。说明通过抑制端粒酶活性不仅可作用于PCO的LECs，更重要的是对其“起源细胞”即赤道部LECs也有作用。这为抑制白内障术后LECs的增殖提供理论和实践依据。

3 端粒酶活性的调节与白内障的发生发展

3.1 端粒酶活性的诱导 各种慢性氧化作用可损伤LECs的端粒结构，加剧端粒的缩短，设法通过上调端粒酶的活性而维持端粒的正常长度则可以防止LECs的凋亡。因TERT联合TR时有促进细胞增殖的作用，TERT单独存在时则发挥抗凋亡与促修复的作用以保护LECs免遭诸如紫外线辐射等导致的急慢性氧化损伤，通过基因手段仅转染TERT基因诱导端粒酶活性后不会同时加剧LECs的增殖而加重白内障。转染hTERT基因可改变核基质与端粒的结合，下调细胞衰老相关基因的表达，上调DNA修复相关基因活性，增加端粒的稳定性，降低染色体自发损伤，使细胞保持表型的年轻状态。hTERT在端粒延长过程中起着不可替代的作用，利用现代分子生物学技术改变端粒酶尤其是hTERT的基因表达水平，将成为白内障基因治疗的一个新突破口。1998年，Bodnar等［14］首先将外源性 hTERT 导入原本无端粒酶活性的人视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞中，其端粒酶转为阳性，端粒保持稳定，细胞寿命延长。2005年，研究者们发现将hTERT基因导入牛LECs抑制该细胞的分化［15］，LECs进入细胞凋亡归因于端粒的缩短以及分化标记物-β晶体蛋白的积累。hTERT通过合成新的端粒防止细胞凋亡，同时调控蛋白激酶C、蛋白激酶A的表达，最终抑制MEK/ERK信号通路，从而抑制β晶体蛋白的分化。因转染hTERT基因所诱导的端粒酶活性在LECs中起保护作用而非促增殖作用［16］。所以通过转染hTERT的基因手段诱导端粒酶活性的方法消除了端粒酶促细胞增殖的作用，很大程度上减少全身性诱导端粒酶活性诱发其他端粒酶敏感组织发生恶性肿瘤的副作用。

hTERT基因表达的调控主要发生在转录水平，受多种转录因子调控，激活因子包括c-Myc癌基因、squmosa启动子结合样蛋白(squmosa promoter binding protein like，SPl)、核转录因子-κB(nuclear factor，NF-κB)、上游刺激因子(upstream stimulating factor，USF)、病毒基因如人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、细胞核因子 (nuclear factor，NFAT)等［17］。这些转录激活因子作为重要的端粒酶激活剂，可显著上调hTERT启动子的表达，并且与其剂量呈正相关。

3.2 端粒酶活性的抑制 PCO是白内障术后最常见的影响视力的并发症［18］。PCO的LECs中存在着端粒酶活性。端粒酶在PCO中扮演着促进细胞增殖的作用，抑制端粒酶活性在防治PCO中的应用价值显得尤为重要。近年来，以端粒酶为靶点的抑制剂广被报道［19］，例如:目前正处于三期临床试验的寡核苷酸类端粒酶抑制剂GRN163L［20］等，该类药物主要是利用反义技术对hTR进行抑制，GRN163及其类似物GRN163L是一个极其成功的寡核苷酸类模版抑制剂，其最独特的作用在于对干细胞的抑制作用明显。其他类型的端粒酶抑制剂如核苷类逆转录酶抑制剂 ddG、AZT等，非核苷类小分子抑制剂MKT077、BIBR1532 等，G-四联体稳定剂 SOT-095等。2012年，Lu等［21］在探讨 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)抑制hTERT对LECs增殖的影响时得出结论:较长时间RNAi hTERT能有效抑制LECs增殖。转录抑制因子在基因水平上对端粒酶活性进行负向调控，包括p53、肿瘤基因(wilms tumor1，WTl)、Madl转录因子和巨噬细胞活化因子-2(macrophage activating fsctors，MAF-2)等［22］。抑癌基因 p53 对hTERT基因的转录抑制作用表现在:一方面通过抑制Sp1结合到其启动子上而间接实现。另一方面，在DNA损伤的同时，活化的p53诱导生长因子的表达从而激活RAS/RAF/MEK/ERK信号通路。

3.3 端粒酶活性的其他调节方式 人类透明晶状体中含有大量的L-肌肽，成熟白内障晶状体中却明显耗 尽。 研 究 表 明［23-25］，N-乙 酰 肌 肽 (N-acetyl carnosine，NAC)滴眼液所释放的肌肽在生理浓度便可显著降低在缺乏有效抗氧化保护的LECs中由氧化应激所导致的端粒缩短率。在NAC滴眼液治疗的老年性白内障患者中其视力与光敏感度相比对照组表现出显著改善。局部使用NAC与羧甲基纤维素混合的眼液可以使肌肽缓慢地释放入房水和晶状体中，通过减少氧化应激损伤而减少LECs中的端粒缩短，从而防止LECs的凋亡。NAC抑制LECs凋亡可作为年龄相关性白内障以及PCO的一种基本预防保健措施。

LECs进入G1/S期后端粒酶活性逐渐增高，于S期达最高，进入G2/M期后细胞几乎丧失端粒酶活性。雌激素使细胞周期发生改变，使更多的细胞进入S期从而提高端粒酶活性［24］。另有研究［25］发现在白内障 LECs中，雌激素受体(estrogen receptor，ERα)与TERT之间存在相互作用，但在正常LECs中ERα和TERT之间却不存在这种相互作用。白内障LECs中ERα蛋白及端粒酶mRNA的表达较正常LECs增加，ERα通过某种机制可以增加 LECs中TERT的表达。

4 小结

端粒酶活性与白内障的发生发展密切相关，以端粒酶为靶点可能成为白内障治疗的一个新方向。目前该领域研究尚存在以下问题:(1)对端粒酶活性与白内障的研究主要集中在年龄相关性白内障与PCO，而在其他类型白内障研究中尚未展开。(2)LECs中端粒酶活性的变化调节可能存在不同的、复杂的调控机制。由此预测，对不同类型白内障以及同种类型不同LECs发育时期端粒酶活性及作用变化规律的深入探索，在LECs发生、发育的不用时期采用诱导或抑制端粒酶活性等干预措施，可能会成为白内障治疗的新靶点。

1 Cong Y，Shay JW.Actions of human telomerase beyond telomeres［J］.Cell Res，2008，18(7):725-732.

2 Colitz CM，Davidson MG，McGahan MC.Telomerase activity in lens epithelial cells of normal and cataractous lenses［J］.Exp Eye Res，1999，69(6):641-649.

3 Kong CM，Lee XW，Wang X.Telomere shortening in human diseases［J］.FEBS，2013，280(14):3180-3193.

4 Xiang H，Wang J，Mao YW，Li DW.hTERT can function with rabbit telomerase RNA:regulation of gene expression and attenuation of apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，278(3):503-510.

5 Lu H，Lei Z，Lu Z，Lu Q，Lu C，Chen W，et al.Silencing tankyrase and telomerase promotes A549 human lung adenocarcinoma cell apoptosis and inhibits proliferation［J］.Oncol Rep，2013，30(4):1745-1752.

6 Korkmaz M，Avcl CB，Gunduz C，Aygunes D，Erbaykent-Tepedelen B.Disodium pentaborate decahydrate(DPD)induced apoptosis by decreasing hTERT enzyme activity and disrupting F-actin organization of prostate cancer cells［J］.Tumour Biology，2014，35(2):1531-1538.

7 Sorte K，Sune P，Bhake A，Shivkumar VB，Gangane N，Basak A.Quantitative assessment of DNA damage directly in lens epithelial cells from senile cataract patients［J］.Mol Vis，2011，17:1-6.

8 Colitz CM，Barden CA，Lu P，Chandler HL.Ultraviolet irradiation upregulates telomerase transcription and activity in lens epithelial cells［J］.Vet Ophthalmol，2006，9(5):379-385.

9 Slijepcevic P.The role of DNA damage response proteins at telomeresan‘integrative’model［J］.DNA Repair(Amst)，2006，5(11):1299-1306.

10 Babizhayev MA，Vishnyakova KS，Yegorov YE.Telomere-dependent senescent phenotype of lens epithelial cells as a biological marker of aging and cataractogenesis:the role of oxidative stress intensity and specificmechanism of phospholipid hydroperoxide toxicity in lens and aqueous［J］.Fundam Clin Pharmacol，2011，25(2):139-162.

11徐国兴，武莉莉，郑学栋，胡建章，王婷婷，林鸿.端粒酶在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达及意义［J］.眼科研究，2005，23(6):593-595.

12杜敏，马蕾，田蕊蕊，郭道静，牛永亮，周瑞芳.白内障晶状体细胞端粒酶与凋亡增龄性研究［J］.中国实用眼科杂志，2010，28(8):847-849.

13 Lü ZG，Huang WL，Jiang YX，Liu TJ.Expression and significance of telomerase activity of lens epithelial cells in posterior capsule opacification of rabbits［J］.Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2008，44(10):902-905.

14 Bodnar AG，Ouellette M，Frolkis M，Holt SE，Chiu CP，Morin GB，et al.Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells［J］.Science，1998，279(5349):349-352.

15 Wang J，Feng H，Huang XQ，Xiang H，Mao YW，Liu JP，et al.Human telomerase reverse transcriptase immortalizes bovine lens epithelial cells and suppresses differentiation through regulation of the ERK signaling pathway［J］.J Biol Chem，2005，280(24):22776-22787.

16 Colitz CM，Whittington A，Carter R.The effects of oxidative stress on telomerase activity and other stress-related proteins in lens epithelial cells［J］.Exp Eye Res，2004，78(2):235-242.

17 Jiang S，Galindo MR，Jarret HW.Purification and identification of a transcription factor，USF-2，binding to E-box element in the promoter of human teomerase reverse transcriptase(hTERT)［J］.Proteomics，2010，10(2):203-211.

18 Awasthi N，Gun S，Wagner BJ.Posterior capsular opacification，a problem reduced but not yet eradicated［J］.Arch Ophthalmol，2009，127(4):555-562.

19 Rudolph KL.Telomeres and telomerase in ageing，disease，and cancermolecular mechanisms of adult stem cell ageing［M］.Germany:University of Ulm，2008:261-268.

20 Tokcaer-keskin Z，Dikmenz G，Ayaloglu-butun F，Gultekin S，Gryaznov SM，Akcali KC.The effect of telomerase template antagonist GRN163L on bone-marrow-derived Rat mesenchymal stem cells is reversible and associated with altered expression of cyclin d1，cdk4 and cdk6［J］.Stem Cell Rev Rep，2010，6(2):224-233.

21蒋永祥，吴新华，卢奕.RNA干扰抑制端粒酶反转录酶对晶状体上皮细胞增殖的影响［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2012，12(3):157-159.

22 Xu Y，Suzuki Y，Ito K，Komiyama M.Telomeric repeat-containing RNA structure in living cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(33):14579-14584.

23 Babizhayev MA，Yegorov YE.Telomere attrition in lens epithelial cellsa target for N-acetylcarnosine therapy［J］.Front Biosci，2010，15:934-956.

24 Peital P，Mello SS，Campart ML，Passos GA，Hande MP，Cardoso RS，et al.Chromosomal rearrangements involving telomeric DNA sequences in BAL31b/3T3 cells transfected with the Ha-rasoncogene［J］.Mutagenesis，2002，17(1):67-72.

25 Colitz CM，Sugimoto Y，Lu P，Barden CA，Thomas-Ahner J，Chandler HL.ERalpha increases expression and interacts with TERT in cataractous canine lens epithelial cells［J］.Mol Vis，2009，15:2259-2267.