利用质谱技术解析糖类结构的研究进展

贾秀娟，刘有军，杨 焕，周义发

(1. 东北师范大学生命科学学院，吉林 长春 130024；2. 空军航空大学飞行基础训练基地，吉林 长春 130022；3. 东北师范大学图书馆，吉林 长春 130024)

糖的研究已有100多年的历史，过去人们一直认为糖类物质在生物体内只是一种能量物质或结构物质，随着对糖类研究的不断深入，人们发现糖具有多种重要的生理活性，一切重要的生命活动过程(包括胚胎发育、细胞癌变、病毒感染以及植物生长调节等)都有糖链的参与[1]。糖的结构与其功能密切相关，要了解糖的功能首先要对其结构进行分析。

糖类化合物以多种形式存在于自然界中，主要包括单糖及其衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类。复合多糖包括糖蛋白和糖脂两大类。与其他生物大分子一样，糖链的一级结构是二级以上高级结构的基础。但与蛋白质、核酸相比，糖链的一级结构更为复杂。要测定糖链的一级结构，需要解决以下几方面的问题：1)糖链的分子质量；2)糖链的糖基组成，各种组成单糖的比例；3)每一个单糖残基的D-或L-构型，吡喃环或呋喃环形式；4)各个单糖残基之间的连接次序；5)每个糖苷键所取的α-或β-异头异构形式；6)每个糖残基上羟基被取代的情况，有2个以上羟基被同时取代，则意味着这个糖残基处在叉状链的分支点上；7)糖链和非糖部分(肽链、脂类物质等)连接点的情况[2]。

显然，要弄清楚上述所有问题，不是一种技术或方法就可以做到的。到目前为止，已建立的糖结构解析方法有：化学方法(甲基化分析、部分酸水解、smith降解、过碘酸氧化、乙酰解、甲醇解等)和生物学方法(酶解、免疫学方法等)。近年来，物理学方法(核磁共振、红外光谱、激光拉曼光谱及色谱等)也用于糖类物质的分析。糖类物质结构复杂，涉及到立体异构体(一个单糖若含有4个不对称碳，则有24个立体异构体)，单糖之间的连接位置(1-1、1-2、1-3、1-4、1-6连接)和每个糖苷键的α、β构型[3]。此外，糖链还具有微观不均一性。因此，传统的分析技术在糖链结构分析中遇到了瓶颈。直到20世纪50年代末，质谱技术开始用于糖的分析，促进了糖类研究的快速发展。质谱以其灵敏度高、信息直观等特点，已成为糖链研究中重要的、不可缺少的手段。特别是80年代末，各种软电离技术的相继诞生，使高极性、难挥发、热不稳定的糖及其复合物的直接分析成为可能[4-8]。本工作将综述各种质谱技术在糖类物质分析中的应用进展。

1 电子轰击质谱(electron impact mass spectrometry, EI-MS)

质谱法研究糖的结构已有50多年的历史。EI-MS是最早用于糖类分析的质谱技术，样品经气化后，以分子状态在离子源中与具有一定能量的电子碰撞，从而使样品分子电离，随后具有过剩能量的分子、离子碎裂成各种碎片离子。这些离子在一定的电场作用下，通过分析器把具有不同质荷比的离子分开，最后到达接收器。它具有较好的重复性、较高的灵敏度和较多的碎片峰。EI-MS可以得到低聚糖衍生物典型的裂解规律，并可以推断所含的基团以及该化合物的结构[9]；EI-MS还可以研究糖基的连接方式，不同的连接方式使得某些离子的相对强度发生变化，据此来区分连接位置的异构体。Finan等[10]首次应用电子轰击质谱研究了几种单糖和二糖。然而，由于糖的难挥发性和热不稳定性，限制了EI-MS对低聚糖的研究。因此，人们采用衍生化的方法将糖进行甲基化或乙酰化等，使其转变为可挥发的糖衍生物，这对于聚合度较低的糖可以增强挥发性和热稳定性。Moor等[11]较详细地研究了25种低聚糖甲醚，并阐述了质谱在其结构分析上的用途和意义。但是，对于聚合度较高的低聚糖，它们的衍生物挥发度和热稳定性仍然很低，所以不能用EI-MS法研究。目前，EI-MS 分析多糖主要用于甲基化后的气质联机，以测定多糖连接方式[12-14]。

2 化学电离质谱(chemical ionization mass spectrometry, CI-MS)

化学电离质谱是Munson和Field于1966年提出的[15-16]。CI-MS的电离过程是通过反应气产生的反应离子与样品分子之间的离子-分子反应实现的。常用的反应气有甲烷、异丁烷、氨、水、氢等，它们在离子源中的主要离子分别是CH5+、C2H5+、C4H9+、NH4+、(NH3)2H+、(NH3)3H+、H3O+、(H2O)2H+、(H2O)3H+、H3+等。EI-MS虽然可以得到较多的与分子结构相关的碎片离子，但是往往得不到分子离子；而CI-MS由于所传递的能量较少，所以更容易得到较强的分子离子(准分子离子)。在糖类物质的研究中，常以NH3作为反应气，因为它可以提供更为专一的软电离条件，使得糖类可以更有效的电离。以NH3为反应气体，利用CI-MS可以得到[M+NH4]+作为基峰，从而很容易推导出化合物的相对分子质量。Lomax等[17]以NH3为反应气，观察到聚合度为15的多糖。由于CI-MS得到的碎片信息很少，人们经常把2种电离方式相结合以得到更为丰富的质谱信息。例如，陆德培等[18]利用EI-MS和CI-MS研究了全乙酰化低聚木糖质谱，得到了木二糖到木六糖全乙酰化物的裂解机理和特征碎片离子。CI-MS除了可以较好的测定糖的相对分子质量外，还可获得糖的连接方式信息。Reznicek等[19]以氨气为反应气，通过调节气体的压力等参数确定了狗娃花皂甙2中糖部分的连接方式和连接点情况。但CI-MS仍然不适合聚合度高的多糖结构分析。

3 快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)

快原子轰击质谱是20世纪80年代初期发展起来的一种软电离技术[20]，它的出现使在CI-MS和EI-MS中遇到的样品气化问题迎刃而解。FAB-MS的原理是使用快速中性原子，通常用Ar轰击样品表面，使之直接在基质溶液中电离。因为快原子束呈电中性，所以能有效地轰击样品使之发生电离，一般都能得到较强的[M+H]+峰(正离子模式)和[M-H]-峰(负离子模式)作为谱图的主要信号，以及一定反应连接顺序的特征碎片离子峰，使极性高、难挥发、热不稳定的糖及糖缀合物的直接分析成为可能。FAB-MS的典型灵敏度为1 nmol样品/μL基质，它不仅可以测定寡糖及其衍生物的分子质量，而且可以测定聚合度高于30的糖的分子质量[21]。除了测定分子质量外，FAB-MS还可确定糖链中糖残基的连接位点和序列，此方法已广泛用于多糖的分析。Egge等[22-23]对人奶中的寡糖结构进行研究，在测定分子质量的同时，还根据糖的分子质量计算糖残基(如去氧己糖、己糖、己糖胺等)的组成和数量，另外，通过FAB-MS的序列离子分析，推测出八糖的2种异构体结构。 Angel等[24]通过过碘酸对糖的专一性剪切、重氢硼化物还原、甲基化，再利用FAB-MS分析，测定了糖的连接位点。

虽然寡糖在不进行衍生化的情况下可以直接用FAB-MS分析，但是灵敏度较低。为了提高仪器的灵敏度，需在分析条件上进行优化，比如选择更好的轰击粒子、合适的底物或加入某些添加剂等。但更有效的方法是在糖的还原端进行修饰，为质谱分析提供一个荷电中心。例如，连接碱性、疏水性基团或使化合物成盐来提高FAB-MS的分析灵敏度，从而简化对谱图中碎片峰的解析，得到更好的序列离子信息。Anderegg等[25]在麦芽糖的还原端衍生一季胺盐基团，使质谱测定灵敏度提高了约100倍。此外，对糖的羟基进行全甲基化、全乙酰化和全三甲基硅烷化等衍生化，也能显著提高FAB-MS的灵敏度，而且图谱中清晰可辨分子离子和碎片离子，所以，该方法通常被用于天然界中存在的寡糖的序列测定。例如，Grönberg等[26]对人奶中直链或支链寡糖序列的分析测定。全甲基化衍生物由于甲基的引入而使底物相对较小的质量数得到增加，同时大大提高了热稳定性和挥发性，故被用于糖复合物的质谱分析，它既适合CI-MS和EI-MS测定，也适合FAB-MS测定。

4 电喷雾质谱(electro-spray ionization mass spectrometry, ESI-MS)

电喷雾电离是一种软电离技术，起源于1917年，但到80年代才被应用于质谱中。1985年，美国耶鲁大学化工系教授约翰·芬恩(John B. Fenn)首次报道了ESI-MS研究成果，并因发明了对生物大分子的质谱分析法而荣获2002年诺贝尔化学奖。目前的电喷雾接口可以安装在四极杆质谱、磁质谱和飞行时间质谱上。电喷雾电离过程是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量的带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。通过这种软电离方式，ESl-MS 既可以分析大分子也可分析小分子。对于分子质量在1 000 u 以下的小分子, 会产生[M+H]+或[M-H]-离子, 选择相应的正离子或负离子形式进行检测, 就可得到相应的分子质量。而高达20 000 u 的大分子在ESI-MS 中生成一系列多电荷离子, 通过数据处理系统能够得到样品的分子质量, 准确度高于0.01%。据报道，ESI-MS通过多电荷离子已能测出分子质量达2×105的糖蛋白[27-28]。

与FAB-MS相比，ESI-MS还有一个显著的优点，即可以分析含有羧基或硫酸根等官能团的较大寡糖链。Anastyuk等[31]利用串联ESI质谱和MALDI-TOF质谱对褐藻胶糖进行结构分析，结果表明褐藻胶糖中含有非硫酸化的低聚糖和单硫酸化的岩藻寡糖混合物，并且确定了硫酸化位点。

5 基质辅助激光解吸电离质谱 (matrix-assisted laser desorption mass spectrometry, MALDI-MS)

基质辅助激光解吸电离质谱于20世纪80年代末问世，是由德国物理学家Hillenkamp和生物物理学家Karas共同发明的[32]。它是将被分析物的溶液和某种基质(多为有机小分子)溶液按适当比例混合，蒸发溶剂，使被分析物与基质共结晶，再用一定波长的脉冲式激光进行照射，从而实现样品的离子化，产生的离子在飞行管中飞行的时间不同，从而得到分离。基质分子必须能有效吸收激光能量，使基质分子和样品解吸到气相并得到电离。这种离子化方式电离出的离子常用飞行时间(TOF)检测器检测，所以MALDI与TOF连在一起称为基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。它也是一种软电离技术，该技术产生的分子离子稳定，不易裂解。理论上讲，只要飞行管的长度足够长，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，所以被成功地用于蛋白质、糖脂、多糖[33]及寡糖[34]等生物分子的分析。蛋白质和糖蛋白除通常给出强的[M+H]+离子外，还给出较弱的双电荷或多电荷离子，中性寡糖分子给出的是单一的[M+Na]+离子峰。因此，MALDI-TOF-MS可准确、快速、灵敏的测定大分子多糖的分子质量。Stahl等[35]采用3-氨基喹啉作为基质，利用MALDI-TOF-MS分析菊粉中的果聚糖，检测的果聚糖的最大相对分子质量可达10 ku。目前，这项技术可直接测定聚合度达40的多糖[36]。

在MALDI-MS测定中，基质的性质及样品的制备方法对获得理想的质谱图非常关键。基质的作用是稀释样品，吸收激发光能量及解离样品。基质与样品的晶体形态、样品与基质比率对谱图质量都有影响，因此，对于不同的糖类需选择不同的基质才能获得更好的效果[37]。此外，MALDI受样品中所含添加剂、缓冲盐的影响较小，其灵敏度也是各类电离方式中最高的。

与ESI-MS相比，MALDI-TOF-MS具有快速、样品需求量少(fmol～pmol级)、灵敏度高等优点。比较典型的实验是用1 pmol样品，5 min内就可以获得寡糖的分子质量，其准确度最多相差0.5个质量数[38]。对糖而言，MALDI-TOF-MS过去主要用于分子质量的测定。1994年，Kaufmann发现源后衰变过程(post-source decay, PSD)能被折光仪检测[39]，因此，借助PSD方式下的折光TOF仪，MALDI-TOF-MS不再仅局限于分子质量的测定，在subpmol量范围内也能提供详细的寡糖及糖复合物的结构信息[40]。Hilz等[41]分析了板栗中木糖葡聚糖的分支情况。Jacobs等[42]分析了水溶性半纤维素的乙酰基取代情况。为了进一步加强对生物大分子结构的解析能力，人们又发展了MALDI的碰撞诱导裂解(CID)技术。与MALDI-PSD相比，CID更稳定。CID技术是指在离子源的后面增加一个碰撞腔，对离子进行碰撞碎裂，可获得更细微的结构信息。Spina等[43]用氦气作为碰撞气体，DHB为基质，用CID将离子再次打碎后进行分析，对Lacto-N-Fu-copentaode I(LNFP I)的序列进行测定，通过糖还原末端碎片辨认出一系列离子，从而得到糖的序列信息。由于MALDI-TOF-MS具有其他方法不可取代的优势，相信会成为适用范围更广的测定糖复合物分子质量及其结构的方法。

6 色谱-质谱联用技术在糖分析中的应用

色谱是一种很好的分离手段，可以将复杂混合物中的各个组分分离开，但是它在糖复合物的结构分析方面表现较差。而质谱可以在一次分析中提供丰富的结构信息，能进行有效的定性和定量分析。因此，将两者结合是进行糖复合物高效分析的重要方法。

气相色谱-质谱(GC/MS)是一种以气相色谱系统作为质谱进样系统的分离检测技术，已成为一项标准化气相色谱技术被广泛使用。在应用GC/MS进行多糖结构分析时，通常先将其降解为结构简单的单糖或寡糖，再衍生成易挥发、热稳定的衍生物，通过对降解糖衍生物的定性、定量分析，可以得到多糖的基本结构。例如：先将多糖中的自由羟基完全甲基化，然后完全酸水解，将醛基还原，再进行乙酰化得到挥发性乙酰化衍生物，然后进行GC/MS分析。这项技术在糖复合物结构分析中得到普遍应用，如Liu等[44]对海胆黄多糖(SEP)进行结构分析，认为SEP是以1→4糖苷键连接为主链的葡聚糖，并且每9个残基的C6位上有1个1→6糖苷键连接的葡萄糖支链。徐年军等[45]利用GC/MS分析了海洋滩涂生物大米草中的多糖。胡坪等[46]对大黄多糖RP-1，RP-2，RP-3的结构进行研究。结果表明：RP-1 由葡萄糖残基构成，主要连接方式为1，4-连接，并在O-6 位出现支链；RP-2 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸组成，主要含有1，4-葡萄糖残基，同时还有1，2-鼠李糖、1，4，6-甘露糖、葡萄糖等残基；RP-3 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸组成，主要糖单元为1，5-连接的五碳糖。目前已经建立了关于GC/MS分析多糖结构的数据库，应用最为广泛的有NIST库和WILEY库。

许多不稳定或不容易挥发的物质不能利用GC分离，可以用液相色谱(LC)代替GC与质谱联用。与GC/MS相比，LC/MS省去了甲基化、乙酰化等繁琐的样品前处理过程。HPLC/MS能对更复杂的糖链进行分析，例如，梁达清等[47]采用HPLC-ESI-IT-MS方法测定了巴戟天中低聚糖的总含量和各种低聚糖的含量，通过质谱图解析，确定了巴戟天中4种低聚糖的结构，并在巴戟天中发现了相对分子质量为342 u 的二聚体和相对分子质量为504 u的三聚糖；赵瑜等[48]利用HPLC-MS/MS对烟草中的7种糖类物质进行了定量分析，检测方法在2～200 mg/L范围内线性良好(r>0.999)，检出限均在50.0 mg/L以内。目前，LC/MS分析糖复合物结构的数据库不及GC/MS完善，数据分析上有一定的困难，需要不断地探索和补充。

7 结论

在糖链分析中，质谱既可以获得糖链样品的相对分子质量的指纹图谱，又可以与气相色谱、液相色谱联用进行糖链样品的定性定量分析。质谱既可以得到糖链样品的单糖组成及含量，也可以用来测定糖链的序列和分析糖链的连接方式。随着质谱技术的不断发展，糖链的释放和衍生化方法的不断改进，以及谱图解析工作的进一步深入，质谱技术必将成为糖分析的有力工具。

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