GC-QqQ-MS/MS法检测油脂类功能食品中辐照标志物2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮

刘 茜，韩 丽，伊雄海，时逸吟，张 浩，王国明，彭 涛，杨振宇，任 硕

(1. 上海杉达学院，上海 201209；2. 上海出入境检验检疫局，上海 200135；3. 重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；4. 中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

含油脂食品经辐照，食品中的游离脂肪酸和三酰基甘油可形成2-烷基环丁酮(2-alkylcyclobutanones, 2-ACBs)，2-ACBs有着与母体脂肪酸相同的碳原子数，且烷基位于2号环位上。脂肪酸或三酰基甘油的羰基氧失去一个电子形成环状化合物，再经重排形成特定脂肪酸的2-ACBs[1-3]，简化机理示于图1。2-十二烷基环丁酮(2-dodecylcyclobutanone，2-DCB)是棕榈酸(C16∶0)的辐解产物，2-十四烷基环丁酮(2-tetradecylcyclobutanone，2-TCB)是硬脂酸(C18∶0)的辐解产物，它们都是2-ACBs的一员[4]。至今，尚未在未经辐照的食品中发现2-ACBs，因此可将其作为鉴定辐照油脂类食品的标志物。

目前有猪肉[5]、鸡肉、鱼肉[6-7]、花生、饼干[8]和牛肉[9]等含脂食品中2-ACBs检测方法的报道，所使用的检测技术有GC/MS法[10-11]和HPLC-ESI-MS/MS法[12]。但未见辐照油脂类功能食品，如鱼油、南瓜籽油、大蒜油软胶囊等的报道。

由于软胶囊类基质复杂，2-ACBs是脂溶性化合物，很难与基质分离，而串联质谱具有高选择性与高灵敏度，能够对复杂基质中的痕量物质进行确证分析[13-14]。因此，本研究拟通过优化固相萃取(SPE)条件，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-QqQ-MS/MS)同时测定油脂类功能食品中辐照标志物2-DCB和2-TCB，旨为该类食品的检测工作提供理论依据。

图1 2-烷基环丁酮形成的简化机理Fig.1 The simplified mechanism of 2-alkylcyclobutanones

1 实验部分

1.1 仪器和材料、试剂

7890A-7000型气相色谱-三重四极杆串联质谱仪：美国Agilent公司产品；ProElut Silica硅胶固相萃取柱(2 g/12 mL)，12孔固相萃取装置：上海Dikma公司产品；R-215型旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司产品；XS603S型电子天平：美国Mettler Toledo公司产品。

鱼油、南瓜籽油、亚麻籽油和大蒜油软胶囊：均为未经辐照的空白样品；2-DCB、2-TCB标准品(纯度≥98 %)：美国Sigma公司产品；正己烷(色谱纯)：美国J.T.Baker 公司产品；叔丁基甲醚(色谱纯)：美国Sigma公司产品；水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制 分别准确称取100 mg 2-DCB和2-TCB标准品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，分别得到1.0 g/L 标准储备液。

1.2.2辐照处理 通过60Co辐照源进行辐照(中国科学院上海辐照中心)，剂量率为0.5 kGy/h，空白鱼油、南瓜籽油、亚麻籽油和大蒜油软胶囊样品的辐照剂量分别为0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 kGy。

1.2.3样品处理 称取0.30 g样品(精确至0.001 g)于具塞离心管中，加入2 mL 正己烷，充分涡旋混合，待净化。依次用10 mL叔丁基甲醚，10 mL正己烷缓慢润湿固相萃取柱，活化填料；将待净化液转移至萃取柱，弃去流出液；用10 mL正己烷淋洗；20 mLV(叔丁基甲醚)∶V(正己烷)=1∶99的溶液洗脱，250 mL旋转蒸发瓶接收。整个过程的流速控制在1 mL/min，直至洗脱液完全自然滴出。在35 ℃下，减压蒸馏至约2 mL后，自然挥干，用正己烷定容至1 mL，待GC-QqQ-MS/MS分析。

1.2.4色谱条件 色谱柱：DB-5MS(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He(99.995%)；恒流，流速1.0 mL/min；不分流进样，进样量1 μL，进样口温度260 ℃；程序升温：起始温度80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至150 ℃，再以8 ℃/min升至200 ℃，然后以20 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。

1.2.5质谱条件 电子轰击离子化(EI)，离子源温度200 ℃，电离能量70 eV，传输线温度280 ℃，溶剂延迟时间5.0 min。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱的选择

对于油脂类样品，采用固相萃取柱进行样品净化是必不可少的步骤。本实验采用了ProElut Silica柱、硅胶柱[15-16]、中性氧化铝柱[12]、Florisil柱[17-18]、PSA柱等固相萃取柱以及GPC方法进行样品的净化。由于2-ACBs的分子质量较小，利用GPC方法的保留时间短，有大量杂质干扰，无法进行定性定量分析，因此没有选用GPC方法。对于油脂类功能性食品，ProElut Silica柱相对于其他填料的固相萃取柱来说，2-DCB和2-TCB的回收率较高，能更好的排除杂质干扰，达到良好的净化效果，可以满足分析检测的要求，样品检测的色谱图示于图2。

2.2 质谱条件的优化

首先用1.0 mg/L混合标准溶液进行全扫描分析，获得2-DCB和2-TCB的一级质谱图。对一级质谱图进行分析，比较各碎片离子的相对丰度，选择丰度较高的2～3个离子作为母离子。每个化合物选择1个母离子，设定不同的碰撞能量，对其产生的二级质谱碎片离子进行扫描，得到子离子扫描质谱图，选择响应最好的2～3个碎片离子作为子离子。对不同的母离子、子离子以及碰撞电压进行优化，结果列于表1。

图2 未辐照鱼油样品(a)，0.03 mg/L 2-DCB和2-TCB标准品(b)，未辐照加标鱼油样品(0.1 mg/kg鱼油，c)，辐照未加标鱼油样品(2 kGy，d)的GC-QqQ-MS/MS色谱图Fig.2 GC-QqQ-MS/MS chromatograms of non-irradiated fish oil (a), 2-DCB and 2-TCB at 0.03 mg/L (b), non-irradiated fish oil spiked at 0.1 mg/kg (c) and non-spiked fish oil irradiated at 2 kGy (d)

化合物 保留时间/min 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量/eV2-DCB12.19883*,703,32-TCB13.911297*,843,3

注：*为定量离子

2.3 方法学验证

2.3.1标准曲线 分别取适量1.0 g/L 2-DCB和2-TCB标准储备液，用正己烷配制成浓度为0.005、0.02、0.1、0.5、1.0 mg/L系列标准工作溶液。按优化的GC-QqQ-MS/MS条件，取1 μL进样，以响应值(y)对质量浓度(x)进行线性回归，回归方程分别为y=60.613 6x-171.295 5和y=19.779 5x-78.831 8，线性相关系数(R2)分别为0.999 8和0.999 9。

2.3.2回收率、精密度和检测限 未辐照样品中不含有2-ACBs，对4种油脂类功能食品进行回收率实验。每个样品添加量分别为0.01、0.05、0.10 mg/kg，每一添加水平的样品数为6个，样品处理和测定按1.2.3～1.2.5进行。分别测定添加样品中2-ACBs的含量，计算添加回收率，加标样品的回收率及精密度列于表2。由表2可见，平均添加回收率为85.6%～97.1%，相对标准偏差(RSD)小于7.0%(n=6)。按照10倍信噪比(S/N)确立的方法，定量限(LOQ)为5 μg/kg。

表2 2-DCB和2-TCB的加标回收率及相对标准偏差

2.4 辐照剂量对辐照油脂类功能性食品中2-ACBs含量的影响

该研究中油脂类功能性食品的辐照剂量分别为0.5、1.0、2.0、5.0、8.0和10.0 kGy，辐照标志物2-DCB和2-TCB浓度与辐照剂量的关系示于图3。从图3可见，在0.5～10.0 kGy辐照剂量范围内，辐照剂量与辐照油脂类功能性食品中2-DCB和2-TCB浓度呈线性正相关关系，这与文献[19-20]的结果一致。2-DCB的回归方程分别为ya=54.161x+20.123(R2=0.999 4)；yb=41.214x+7.137(R2=0.995 6)；yc=46.094x-9.915(R2=0.999 9)；yd=48.658x+28.806(R2=0.996 4)；2-TCB的回归方程分别为ya=20.907x+6.996(R2=0.999 2)；yb=19.285x+2.823(R2=0.995 7)；yc=17.099x+6.814(R2=0.996 6)；yd=18.267x+7.989(R2=0.996 2)。

理论上，该方法不仅能够对经过辐照的油脂类功能食品进行定性鉴别，也可以准确定量，并根据2-ACBs含量判断其经辐照的剂量。事实上，样品贮藏时间、温度等环境条件会对其产生的2-ACBs有不同程度的降解，虽然不同剂量与2-ACBs含量之间存在线性关系，但无法准确、有效的定量。因此，该方法的研究意义在于对油脂类功能食品是否经过辐照给予定性鉴定。

图3 辐照剂量对辐照油脂类功能性食品中2-DCB和2-TCB含量的影响Fig.3 The influence of irradiation dose to 2-DCB and 2-TCB of irradiated fat-containing function foods

3 结论

本实验建立了ProElut Silica固相萃取柱净化、GC-QqQ-MS/MS同时测定辐照油脂类功能食品中2-DCB和2-TCB的方法，并应用于实际样品的检测。实验优化了前处理条件和仪器条件，并对4种软胶囊样品进行检测。该方法可有效地排除软胶囊样品基质的干扰，检测结果准确、灵敏、稳定，能为辐照油脂类功能食品中辐照标志物的检测提供理论依据。

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