液相色谱-串联质谱法检测动物源性水产品中7种微囊藻毒素

杨振宇，周 瑶

(上海出入境检验检疫局，上海 200135)

近年来，水体富营养化现象出现在世界许多大水系中。水体出现富营养化现象时，藻类大量繁殖，产生的一些溶于水的代谢物(如藻毒素)不仅可使水体生物死亡，甚至可以通过饮用水和水产品富集危害人类健康。在水华藻类中，毒性最强、污染范围最广的是蓝藻(blue-green algae)。蓝藻广泛分布于江河、湖沼、海洋等水体中，大多数蓝藻在代谢过程中能产生各种毒素，其中，微囊藻毒素(microcystin，MC)是蓝藻释放的一类具有强烈致癌作用的肝毒素和神经毒素。

MC是一种环肽肝毒素，其结构为环(D-丙氨酸-L-R1-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-R2-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸)。其中,N-甲基脱氢丙氨酸(Mdha)是一种特殊的氨基酸，含有α、β不饱和双键；Adda结构为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸，是MC生物毒性表达所必需的；R1、R2为2种可变L-氨基酸，由于R1、R2位置上的氨基酸不同，环状结构不同位置侧链的不同，以及侧链上甲基化/去甲基化产生的差异，可以形成多种不同结构。目前已从不同微囊藻菌株中分离鉴定了近80种MC结构。本实验将检测的7种MC结构中R1与R2的氨基酸种类列于表1。

表1 7种MC结构中R1与R2的氨基酸种类

MC具有水溶性和耐热性，易溶于甲醇，可溶于水。由于环状结构和间隔双键，其结构具有相当的稳定性[1-2]。肝脏是MC主要的靶器官，所以肝毒性是MC的主要毒性，在低浓度时就有专有肝毒性和癌诱发活性。同时，MC也表现出胚胎发育、免疫、遗传等方面的毒性[1-3]。MC不仅能直接导致一些水生生物(如鱼类、贝类及蚌类)患病及死亡，而且一些野生动物及家畜饮用了含有藻毒素的水后，会引起中毒甚至死亡，同时还可能通过食物链的生物富集危害人类的健康。

MC的检测方法较多[4-6]，可分为液相检测方法[7-8]、生物学方法[9]和免疫检测法[10-11]等。液相色谱-串联质谱由于定性准确、定量灵敏，是微量毒素分析最有效的检测技术[11-18]。本实验拟采用固相萃取和基质分散固相萃取两种前处理方法，用液相色谱-串联质谱法检测水产品中7种MC。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

TSQ Quantum Ultra液相色谱-串联质谱仪：美国Thermo-Fisher公司产品，配有Accela液相色谱仪；Allegla X-22R高速离心机：美国Beckman Coulter公司产品；PT2100均质仪：Poly TRO公司产品；QGC-12T氮吹仪：上海泉岛公司产品；890/H超声仪：德国Elma公司产品；KMC-1 300 V涡旋振荡器： Vision公司产品；固相萃取装置：美国Supelco公司产品；Waters Oasis HLB固相萃取小柱：美国Waters公司产品；DSPE PSA/C18 MSPD基质分散固相萃取管：德国CNW公司产品；水相针式滤膜(聚醚砜材质，13 mm×0.22 μm)：德国CNW公司产品。

1.2 主要材料和试剂

水：满足GB/T 6682规定的一级水要求；甲醇：色谱纯；甲酸：色谱纯，含量≥98%；正己烷：分析纯。

MC标准品(MC-RR、LR、YR、LA、LW、LF、LY微囊藻毒素固体标准)： 瑞士Alexis公司产品。MC-RR、MC-LR为0.1 mg，其它均为0.025 mg，使用前用甲醇稀释，配成7种MC混合标准溶液，20%甲醇定容。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD C18 (50 mm×2.1 mm×1.9 μm)；柱温35 ℃；进样量10 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～3 min、20%B，3～5 min、20%～95%B，5～5.1 min、95%～20%B，5.1～7 min、20%B。

1.3.2质谱条件 电喷雾正离子模式，多反应监测，喷雾电压3.5 kV，喷雾温度300 ℃，鞘气气压30，辅助气压10，毛细传输管温度270 ℃。母离子、子离子和相关参数列于表2。

1.4 前处理方法

1.4.1样品匀浆 准确称取2 g淡水产品的食用部分于50 mL离心管中，加入5 mL 80%甲醇水溶液，匀质器上以20 000 r/min混合1 min，使样品均质成匀浆，然后超声15 min，以4 000 r/min离心5 min。

1.4.2固相萃取法(SPE) 将1.4.1离心后的上清液转移至试管中，70 ℃氮吹至约0.5 mL，加水至约10 mL，待SPE柱净化。HLB固相萃取小柱在使用前应分别用5 mL甲醇和水以1～2 mL/min流速淋洗活化，活化后的小柱应尽快使用。将10 mL样液转移到HLB小柱上，控制上样流速为1～2 mL/min；用5 mL 10%甲醇以1～2 mL/min流速淋洗，抽干；用5 mL 80%甲醇溶液以1 mL/min流速洗脱；收集洗脱液，并于70 ℃下氮吹至近干；最后用20%甲醇水溶液定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱仪测定。

表2 7种MC分析物的母离子、子离子和相关参数

注：*为定量离子

1.4.3基质分散固相萃取法(MSPD) 将1.4.1离心后的上清液转移到DSPE PSA/C18 MSPD基质分散固相萃取管中，振摇2 min，以4 000 r/min离心5 min，取全部上清液至10 mL比色管中，用水定容至5 mL。混匀后，取1 mL溶液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱仪测定。

2 结果和讨论

2.1 质谱条件的优化

配制10 mg/L的MC标准溶液，分别对每个MC标准溶液进行母离子和子离子的参数优化。

由于ESI离子源是一种软电离方式，大部分目标化合物会形成1价离子，也可能形成2价离子、多价离子或者其他加合离子。由表2可以看出，大部分MC主要形成加氢的1价正离子，但MC-RR的离子形成与其他离子不同，它产生2价离子的产率要比形成其他离子的高，所以选用m/z519.8[M+2H]2+作为MC-RR母离子。

子离子以m/z135、213、375为主，这3种子离子都是MC的特征子离子，具体分子式和结构见表3和图1。m/z135是MC的共有基团3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)的甲氧键断裂形成的特征碎片，它在MC-LR、MC-RR、MC-YR子离子质谱图上的丰度最大，其他MC的子离子也含有此离子。另外，m/z213、375也是大部分MC共有结构的特征碎片，所以本实验所检测的7种MC的子离子也都有这2种质量数的碎片。MC-RR、LR、YR将m/z135作为定量离子，其他4种MC用m/z375作为定量离子。

为了得到较高的离子化效率，在使用ESI离子源时，需加入一些离子化增强试剂。本实验采用甲酸作为离子化试剂，并对流动相中的甲酸含量进行优化实验，不同甲酸浓度对灵敏度的影响示于图2。

表3 子离子的分子式

图1 3种子离子可能的碎裂方式Fig.1 The possible fragmentation of daughter ions

图2 不同甲酸浓度对灵敏度的影响 Fig.2 Effect of different concentrations of formic acid on sensitivity

从图2可以看到，加入甲酸后，MC-LA、LY、LF、LW的灵敏度大大增加，但在0.1%和0.2%甲酸含量水平，灵敏度变化不大。所以采用在流动相中添加0.1%甲酸，优化后的总离子流图和定量离子色谱图示于图3。

2.2 前处理方法的选择

根据文献[2]和MC本身的特性，SPE柱一般用C18小柱或者HLB小柱净化和富集样品。本实验对HLB小柱的淋洗条件做了回收实验，步骤如下：在活化的HLB小柱上，上样10 mL含7种MC的水样，其中每种MC各20 ng，然后分别用5 mL 100%水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇水溶液、100%甲醇进行洗脱，分别收集洗脱液，上机测量MC含量，并计算洗脱液中7种MC含量。结果发现：RR在50%～80%甲醇水淋洗段被淋洗下来；YR、LR、LA、LF、LW、LY在20%～80%甲醇水淋洗段被淋洗下来。所以本实验使用10%甲醇水溶液淋洗，80%甲醇水溶液洗脱。

目前，基质分散固相萃取方法(matrix solid phase dispersion，MSPD)已被用于多种残留分析的前处理[19-20]，在MC检测中，MSPD也有一些应用[21-22]。

本实验采用CNW公司的DSPE PSA/C18 MSPD基质分散固相萃取管。这是一根容积为15 mL的离心管，里面灌装了150 mg PSA、150 mg C18、900 mg无水硫酸镁等固体粉末。当样品的甲醇水提取液倒入MSPD管，C18会吸附其中的非极性物质，PSA(乙二胺-N-丙基)会吸附脂肪酸、有机酸、极性色素、糖类等物质，硫酸镁则会吸附水，同时吸附水溶性杂质，而MC则会留在甲醇溶液中，从而达到净化的目的。需要指出的是，该净化效果不如过柱法好，检出限差，回收率相对较低，但该过程的检测时间短、操作方便、检出限符合要求，是快速简便的方法。

2.3 方法指标

根据不同前处理方法导致的不同检出限，设置了不同的添加水平，对水产品中MC进行回收率和精密度实验。SPE法的添加水平为0.5、1、2 μg/kg；MSPD法的添加水平为2.5、5、10 μg/kg，对应上机溶液中的MC含量水平为1、2、4 μg/L。选取了均为阴性样品的笋壳鱼肉和蛳螺肉作为添加样品基质，平行测量6次，结果列于表4。

由表4可以看到出：SPE法的回收率为75%～106%，相对标准偏差小于20%；MSPD法的回收率为73%～93%，相对标准偏差小于19%。

图3 7种MC的色谱图Fig.3 Chromatograms of 7 MCs

MC名称SPE法回收率/%相对标准偏差/%MSPD法回收率/%相对标准偏差/%RR77～98<2073～85<15YR75～93<1673～89<13LR81～96<1082～93<16LA78～102<1375～90<19LF83～106<1277～91<12LW86～96<1380～89<8LY82～93<1078～93<11

3 结论

建立了液相色谱-串联质谱测定动物源性水产品中7种MC的方法，7种MC在0.5～20 μg/L范围内线性良好。根据动物源性水产品样品的情况，建立了SPE和MSPE两种前处理方法。SPE法操作较繁琐，测量过程较长，但检测限较低，为0.5 μg/kg，添加回收率为75%～106%，相对标准偏差小于20%；而MSPD法操作简单，但检测限则不如SPE法，为2.5 μg/kg，添加回收率为73%～93%，相对标准偏差小于19%。因此，可以根据实际要求，选取不同的前处理方法进行检测。

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