翼柄山莴苣愈伤组织分化及试管苗培养的研究

王晓炜，姜云清，张成鸿

(1.大连医科大学基础医学院形态实验室，116044，辽宁，大连;2.大连市结核病医院检验科，116033，辽宁，大连)

0 引言

翼柄山莴苣(Lactura triangulataMaxim)又称野生菜，为菊科苦苣菜属2年生或多年生草本植物[1]，主要分布在我国的东北、华北等地，在辽宁地区的大连、本溪、宽甸等地也有分布，生长于山坡林下和林缘草地等环境[2－3]。在辽宁的南部地区，翼柄山莴苣的嫩茎叶是民间非常受欢迎并具有一定疗效作用的野菜，市场上也有出售。由于翼柄山莴苣的适口性好，农民饲养的猪、羊、兔、鸡、鸭和鹅等畜禽，也都非常喜食翼柄山莴苣的嫩茎叶。几十年前，有的农民发现，把翼柄山莴苣作为青饲料喂饲畜禽，能降低发病率，有助于提高养殖效益。因此，多年来辽宁南部的大连等地区的人们一直在大量的采收翼柄山莴苣作为药用食材，或者作为青饲料喂养畜禽。然而，由于所采收的翼柄山莴苣必须是幼苗才能食用或饲用，由此使野生翼柄山莴苣资源遭到了严重破坏。致使现今出现了不仅难以采收到食用或饲用的野生翼柄山莴苣幼苗，而且每年的8－10月连野生翼柄山莴苣的种子也无法采收到的现象。为保护野生资源和满足栽培的需求，研究者对其进行了愈伤组织分化及试管苗培养的研究。尽管同属植物已有毛脉山莴苣[4]、叶用莴苣[5－7]、结球莴苣[8]的研究报道，但却未见翼柄山莴苣愈伤组织分化及试管苗培养培养的研究报告。

1 材料与方法

1.1 材料来源及预处理

5月下旬，将在大连金州西海岸草地上生长旺盛的翼柄山莴苣植株的地下部一次性浇透4 mg/L青霉素溶液，同时向植株的地上部喷洒3 mg/L青霉素与3 mg/L庆大霉素的混合溶液，进行预先灭菌处理。1 d后，将已经预先灭菌、待做试验材料的全株采回实验室备用。

1.2 材料灭菌

将采回实验室内的植株叶柄、嫩茎和粗壮根分别剪成长2 cm左右的叶柄段、嫩茎段和粗壮根段，采用穿龙薯蓣研究[9]的方法进行材料的灭菌，就会获得无菌的叶柄段、嫩茎段和粗壮根段。

1.3 试验方法

1.3.1 愈伤组织培养 将无菌材料段从灭菌瓶中取出后，放到无菌滤纸上，在吸干多余水分的同时，将无菌材料段两端分别切掉0.5 cm左右，使其形成长约1 cm、两端具有新鲜切口的叶柄段、嫩茎段和粗壮根段，并接种到以下6种培养上培养:1)1/4 MS+琼脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;2)1/4 MS+ 琼脂 4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;3)1/4 MS+琼脂4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L;4)MS+ 琼脂 4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;5)MS+琼脂4.6 g/L+ 蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;6)MS+琼脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L。接种后，分别放到无光(以下称暗培养)和光照强度3 200 Lx(以下称光培养)的条件下培养。进行在不同培养基上、不同材料与光照条件对愈伤组织培养的影响试验。试验重复2次，每次重复间隔时间15 d，每种处理接种30个材料。

1.3.2 嫩茎愈伤组织的分化培养 把以上验证培养获得的74块嫩绿色的颗粒状愈伤组织，从培养瓶中取出后，在无菌培养皿中切成边长约0.3 cm的块状，再接种到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+琼脂0.52 g%和 MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+琼脂0.52 g%+6-BA 0.5 mg/L 2 种培养基为基本培养基，附加浓度分别为0.01mg/L、0.05mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L、0.30 mg/L、0.35 mg/L、0.40 mg/L 的 IAA 和 NAA培养基上，再放到无光照(以下简称暗培养)、光照强度2 000 Lx(以下简称光培养)和光照强度4 000 Lx(以下简称强光培养)的条件下培养，进行不同基本培养基、不同生长素及光照条件对愈伤组织分化的影响试验。该试验重复了1次，每种处理培养40个愈伤组织块。

1.3.3 生长芽试管苗培养 将验证性试验中获得的362块愈伤组织分化出的丛生生长芽，采用以下3种方法处理:1)将0.5 mg/L的IAA溶液倒入具有由愈伤组织分化丛生生长芽的培养瓶中，处理3 d后，将从生芽从基部剪下，使其形成单芽，再接种到1/2 MS+蔗糖14 g/L+琼脂0.48 g不含生根剂的培养基上，进行生根培养(下称方法1);2)将丛生生长芽从基部切下后，马上把下部切口放到IAA 1.8 mg/L的溶液中处理10 min，再接种到1/3 MS+蔗糖36 g/L+琼脂0.52g%+IAA 0.8 mg/L的培养基上，进行生根培养(下称方法2);3)将丛生生长芽从基部剪下后，直接接种到1/3MS+蔗糖36 g/L+琼脂0.52 g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培养基上，进行生根培养(下称方法3)。该试验重复1次，每一种处理接种培养200个生长芽。

1.3.4 试管苗移栽与定植 将2次生根试验分别培养的186株和189株(共375株)试管苗，培养到第28 d时，从培养瓶中取出，直接移栽到上面为一层厚约7 cm砻糠灰的日光温室苗床上。移栽后的前13 d要防止直射光照、保持18～30℃的温度和80%以上的湿度。之后按照温室内条件正常管理。

移栽后第35 d，一次性将温室内移栽成活的326株试管苗定植到大连金州西海岸的草地上，除了初期浇2次透水外，其它按照野生条件进行管理。

2 结果与分析

2.1 不同材料、不同培养基及光照条件下对愈伤组织诱导培养的影响

接种后2个月观察表明，所有暗培养的材料均不能生长出愈伤组织;而在光培养的条件下，只有在6)号培养基上培养的材料能不同程度的生长出愈伤组织。由表1可见，在6)号培养基上以嫩茎段为材料的培养效果最好。在这种培养基上，以嫩茎为材料培养到第8 d时有的嫩茎段切口处就生长出可见淡绿色、直径0.1 cm左右的愈伤组织。随着培养时间的延长，生长出愈伤组织的嫩茎段数不断增加，愈伤组织块越来越大，并且生长的愈伤组织也由最初的淡绿色转化为嫩绿色的颗粒状。在这一试验的基础上，将100个嫩茎段接种到6)号培养基上，进行了2次验证试验，结果2次验证试验分别有74个和76个嫩茎段生长出直径0.9～2.2 cm的嫩绿色的颗粒状愈伤组织。以上结果说明，在光照的条件下，MS+琼脂4.6 g/L+ 蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L这一培养基是翼柄山莴苣嫩茎愈伤组织培养的适宜培养基。

表1 6)号培养基上不同材料对愈伤组织生长的影响(3次试验平均结果)

2.2 嫩茎愈伤组织的分化培养

2次愈伤组织的分化试验结果证明:只有在以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+琼脂0.52g%为基本培养基、附加不同浓度IAA和强光培养的条件下，培养的愈伤组织块才能分化出生长芽，其余任何条件愈伤组织块均不能分化。由表2显示，IAA的浓度不同，分化的效果也不同。在附加浓度为0.05 mg/L IAA的培养基上，分化效果最好。对整个培养过程的观察还发现，在IAA的浓度为0.05 mg/L的培养基上，愈伤组织块分化时间早，分化的生长芽叶片伸展，呈丛生状。在以上2次试验的基础上，又将400个愈伤组织块1次性接种到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 琼脂 0.52g%为基本培养基、附加浓度为0.05 mg/L的IAA培养基上，在光照的条件下进行分化的验证性试验，共有362块愈伤组织分化出丛生生长芽，其它观察统计的指标也获得了与初期2次试验几近一致的结果。以上试验说明:在光照强度4 000 Lx的条件下，翼柄山莴苣嫩茎愈伤组织生长芽分化培养的适宜培养基是MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 琼脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L。

表2 不同浓度IAA对愈伤组织块分化培养的影响

2.3 不同处理方法对生长芽试管苗培养的影响

用以上3种处理方法培养的生长芽，接种28 d统计，结果由表3所示:3种处理方法，培养的生长芽均能生根并生长成试管苗，但用方法3对生长芽进行处理，不仅生根率和试管苗平均生根条数远远好于方法1和方法2，而且对方法3的2次重复试验共培养的375株试管苗的外观长势也很旺盛。上述结果说明，将丛生生长芽从基部剪下后，直接接种到1/3 MS+蔗糖36 g/L+琼脂0.52g+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培养基上，进行生根培养的方法是翼柄山莴苣生长芽试管苗培养的理想方法;也就是说，1/3 MS+蔗糖36 g/L+琼脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L这种培养基是翼柄山莴苣生长芽试管苗培养的适宜培养基。

表3 不同处理方法对生长芽试管苗培养的影响(2次试验平均结果)

2.4 试管苗移栽与定植

35 d后统计，移栽的375株试管苗，成活326株，成活率为86.9%。

定植后1个月统计，共成活并正常生长的试管苗为318株，定植成活率为97.5%。定植的试管苗根系发达，生长旺盛，翌年8月开花，野生翼柄山莴苣的植物学性状都保持不变。

3 讨论

在进行愈伤组织分化培养的试验中，在附加了不同浓度的人工生长素NAA的培养基上，均未见愈伤组织分化;而在附加了9种不同浓度的天然生长素IAA的培养基中，培养的愈伤组织均能不同程度分化。这一现象说明，虽然NAA是愈伤组织分化培养研究中较为常用的生长素[10]，但翼柄山莴苣愈伤组织的分化适宜生长素却是天然生长素IAA。

尽管在培养基中附加了9种不同浓度的天然生长素IAA，培养的愈伤组织都能不同程度分化生长出生长芽，但在低浓度(0.05 mg/L)IAA培养基中分化培养的效果最好。这并不能说明翼柄山莴苣愈伤组织分化更需要低浓度(0.05 mg/L)的IAA，而实际情况是在分化培养过程中，嫩绿色的颗粒状愈伤组织自身能合成部分天然生长素IAA，这不仅提高了天然生长素IAA的浓度，也促进了愈伤组织分化培养生长素的平衡，从而出现了理想分化培养效果。

注:本研究在辽宁省植物工程重点实验室完成。

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