Tail-Cuff技术改良大鼠颈部异位心脏移植模型的效果观察

张金敏，张松林，魏 蕾

(1武汉大学医学院，武汉430071;2三峡大学心血管病研究所)

大鼠颈部心脏移植模型由Heron［1］于1971年创立，该模型具有手术创伤轻、移植物观察灵敏等优点。但由于颈总动脉与升主动脉直径差别较大，该方法对显微技术要求较高，手术时间长，移植物缺血损伤加重，从而限制了其在医学研究中的广泛应用。较多文献［2～5］报道，利用套管技术(Cuff技术)对颈部异位心脏移植模型进行改良，可明显缩短手术操作时间，提高手术成功率;但由于在Cuff管的根部缺乏固定的支撑点，翻转血管时Cuff管易滑动，手术往往需花费较长时间。2012年9月～2013年3月，本研究在总结我们以前应用Tail-cuff技术带尾套管法建立小鼠颈部异位心脏移植模型的基础上［6，7］，应用静脉内导管制作成带有尾巴的套管(Tail-cuff)对大鼠颈部异位心脏移植模型的操作进一步改良。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用清洁级封闭群Wistar大鼠(200～250 g)和SD大鼠(230～300 g)，雌雄不限，分别由武汉大学实验动物中心和华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 手术材料 ZEISS手术显微镜(ZEISS光学仪器国际贸易有限公司);显微手术器械包(宁波医用缝针有限公司);5-0～10-0显微缝线(上海浦东金环医疗用品有限公司)。应用22 G和20 G静脉内套管(BD IntimaⅡTM，苏州BD公司生产)制作Tail-cuff管，该管体长约1.2 mm，尾长约0.5 mm，尾宽约为管周长的1/3～1/2;动脉套管内径约为0.7 mm，静脉套管内径约为1.2 mm;管体中部划一刻痕，以避免结扎的线结脱落。

1.1.3 主要试剂 肝素钠注射液(2 mL/12 500 U)，St.Thomas液，3 g/L 戊巴比妥钠盐水溶液，4%多聚甲醛(武汉博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 采用SD大鼠→SD大鼠进行同系心脏移植(n=20)，Wistar大鼠→SD大鼠进行同种心脏移植(n=24)。供、受者麻醉均用3 g/L的戊巴比妥钠盐水溶液腹腔注射，剂量分别为30、40 mg/kg。所有操作由单人完成。

1.2.2 移植物获取 参照既往文献［2，8～10］并稍作改进，采用腹部正中切口，经下腔静脉注射肝素2 mL(100 U/mL)，2 min后采用U形切口开胸，剪开心包后阻断主动脉弓远端，经头臂动脉注射心脏冷停搏液5 mL，心表面辅以冰屑保护心肌。分别进行胸腺摘取、结扎切断右上腔静脉、右心耳及下腔静脉、左上腔静脉、左心耳、肺静脉等结构的操作，分离主肺动脉间隙软组织后，在头臂动脉近心端切断升主动脉及在左右肺动脉分叉水平切断肺动脉远端，供心取出后以4℃的生理盐水冲洗，分离主肺动脉间隙，然后保存在4℃的St.Thomas液中。

1.2.3 受体血管准备 右颈部纵行切开皮肤，摘除右颌下腺及软组织。暴露右颈外静脉，结扎后去除分支。在右胸锁乳突肌及气管之间，暴露右颈动脉。近心端以无创血管夹阻断后，分别在颈内外动脉及颈外静脉分叉平面结扎切断分支及属支。近心端血管腔以肝素盐水冲洗。在颈外静脉近心端游离缘以10-0缝线缝置1针，然后带针线一起穿过带尾的静脉套管(尾部向血管夹)。用显微血管镊夹住静脉远心端并稍向上提，用另一显微镊把静脉套管尽可能推向近心端，然后用血管夹把套管尾巴及近心端血管同时固定。最后用两把显微镊对血管游离缘进行翻卷，8-0丝线环形结扎固定在预先划好的刻痕上。同法准备右颈总动脉。

1.2.4 移植物植入 供心表面辅以一薄层棉垫，间断性注射4℃生理盐水以减轻供心热缺血损伤。右颈外静脉套管与供心肺动脉连接，用一预置的8-0丝线环形结扎固定;同法连接右颈总动脉套管与供心升主动脉。按顺序移去右颈外静脉及颈总动脉近心端血管夹。心脏移植物颜色迅速由苍白转为红润，60 s左右复跳。以5-0缝线连续缝合颈部切口。

1.2.5 术后观察与处理 术后腹腔注射生理盐水2 mL，一次性肌注青霉素钠(500 U/10 g)。独笼饲养，保温。每日触诊颈部心跳情况以评估心功能，持续心跳≥72 h定为手术成功。分别于移植后第5天和第28天对同种移植物和同系移植物取心肌组织，以4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，进行HE染色。

1.2.6 主要观察指标 记录总操作时间、手术成功率、手术并发症、移植心存活时间及病理学改变。

2 结果

2.1 基本情况 共44只大鼠正式实验，20只同系移植，24只同种移植，手术成功率100%(44/44)。没有麻醉、出血和血栓形成等并发症。移植时间(40.2±6.8)min，翻卷血管和供受体血管连接时间分别为(3.8±1.1)、(2.7±1.3)min。同种移植物生存时间为(6.7±1.8)d，同系移植物生存时间超过28 d。

2.2 病理学切片观察 同系移植组心肌组织形态大致正常，仅见少量炎性细胞浸润;同种移植组心肌组织见大量弥漫性多类型细胞浸润，伴水肿、出血和心肌细胞坏死。

3 讨论

大鼠颈部心脏移植具有明显优势［11，12］:①创伤小;②感染率低;③易于观察心跳情况;④术后存活率高等。但因大鼠血管较细且升主动脉与颈总动脉口径相差较大，进行显微吻合较为困难。套管技术的引入，大大缩短操作时间及心脏缺血时间。但套管技术的核心是如何把游离缘的血管翻卷到套管上并固定。在用套管法建立小鼠颈部心脏移植模型中，Matsuura等［13］的方法是在受体血管游离缘缝置3针固定牵引线，然后均匀用力翻卷，需要双人操作，亦需要一定的显微外科操作基础。Wang等［14］及宋光民等［2］的方法是将供心的无名动脉套在备好的受体颈总动脉套管外，将翻转好的供心肺动脉插入受体颈外静脉内，结扎固定。我们的体会是肺动脉主干很短，不利于制作静脉套管，且可人为缩小血管口径。此外，该方法导致移植物血管蒂较长，易扭曲受压;套管根部不能固定，翻卷血管时套管易于滑动，往往花费很长时间翻卷血管，加重心肌缺血。而有的研究者为了固定套管根部，在血管近心端插入一个针芯［15，16］，这样容易损伤血管内膜导致血栓形成。

本实验中，我们应用Tail-cuff管，很好地解决了套管根部缺乏支撑点的问题。把套管尾巴与血管同时固定在同一血管夹中，套管根部不再滑动，极易翻卷游离缘血管。此外，用22 G和20 G静脉留置管制作Tail-cuff管，壁薄，内径较大，因此供心血流量增加，静脉回流通畅;右颈总动脉与升主动脉连接，缩短移植物血管蒂长度避免扭曲受压;血管连接处为光滑而完整的血管内膜，对血管损伤轻，避免了血管内皮损伤而引起的血栓栓塞等并发症。整个过程由单人完成，不需要专门练习显微操作。该方法的使用，明显减少了吻合口出血、狭窄等并发症［11，17］，明显缩短心脏缺血时间，主要是缩短了翻卷血管和连接血管的时间，并显示了很高的手术成功率和术后生存率。但该方法仍然需要遵循一定的的学习曲线，本研究中正式实验较为满意的结果是在充分总结预实验失败的经验上取得的。

此外，提高该手术成功率需要注意以下几点:①套管中部划一刻痕，避免线结环形固定后松脱，尤其是心脏复跳以后;②制作套管尾巴时其宽度为管周长的1/3～1/2，以避免套管尾巴与受体血管同时固定在同一血管夹后持续渗血;③避免翻卷时扭转受体血管，导致血管连接后不甚通畅，因此在翻卷血管前记住固定线的方向很重要;④我们认为不必要切除右侧胸锁乳头肌，一方面是避免慢性渗血，更重要的是供心移植后肺动脉和主动脉正好骑跨在胸锁乳头肌的两侧，避免了复跳后的供心扭转。

总之，该方法的改进更利于供受体血管的吻合，缩短了心肌缺血时间，显示了极高的手术成功率。因此，应用Tail-cuff技术对于建立大鼠颈部异位心脏移植模型显示出一定的优越性，是一种理想的方法。该技术建立的模型适宜用于移植诱导的缺血再灌注损伤和免疫排斥反应的研究。

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