心房颤动早期阶段心房肌细胞小电导钙激活钾通道的功能改变

于 涛，刘 影，俞晓立，林 伟

(广州医科大学附属第二医院，广州510260)

心房颤动(AF)是临床常见病，心房重构是其重要病理生理基础。小电导钙激活钾(SK)通道是钙激活钾通道家族成员，包括3种亚型(SK1～3)，是介导细胞内Ca2+调控与细胞膜电活动的重要离子通道。近年来发现，SK通道呈“心房选择性”分布，且与AF发生密切相关。本课题组前期工作［1］首次证实，慢性AF患者心房肌细胞SK1、SK2亚型下调。但在AF早期阶段，SK通道功能如何变化却存在争议。本研究观察SK通道在AF早期阶段心房肌细胞中的功能变化并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 成年雄性比格犬8只，体质量13～15 kg。分为快速心房起搏组5只与对照组3只。

1.2 方法

1.2.1 快速心房起搏犬模型的制备 快速心房起搏组犬置于无菌环境、全麻状态下(氯胺酮5.0 mg/kg+地西泮 0.2 mg/kg，静脉注射;1.5%异氟醚吸入)，气管插管后机械通气(潮气量10 mL/kg，频率20次/min)，于胸骨右缘第5肋间开胸，暴露心脏将起搏电极缝合在右心耳部，起搏器(华南理工大学电子研究所制作，输出电压4 V，脉宽0.5 ms)频率调至400次/min，持续起搏4 h。对照组手术方法相同，但不进行起搏。

1.2.2 膜片钳全细胞记录

1.2.2.1 心房肌细胞分离 采用自制改良的Langendorff灌流法和自制的冠脉插管装置［2］。分离后的左心房肌细胞保存在改良KB液中，室温下静置孵育6 h后进行实验。

1.2.2.2 全细胞钙激活钾电流(IK，Ca)记录 选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在24℃条件下进行实验。将适量细胞(约1.5 mL)放于倒置显微镜(OLPUS IX 70型，日本)的细胞池中，贴壁8 min后，开始实验，灌流速度约1.5 mL/min。在电极拉制仪(Narishige PP830型，日本)分两部拉制电极，灌电极液后电阻为2～4 MΩ，并置于推进器上，通过三维操纵器(Narishige，日本)驱动电极，并轻压在细胞表面。用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后，用ZAP或给负压破膜，给予电容及串联电阻补偿，形成全细胞记录。电流信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳AXON 200B放大器放大通过AD/DA转换板(AXON DigiDatal 200，美国)，存储于计算机硬盘中。实验过程由pClAMP9.0软件程序(AXON，美国)刺激发放和信号采集。采用pCLAMP9.0软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换，Prism3.0软件对数据进行曲线拟合及绘制离子通道电流密度—电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线。根据文献［3，4］，本研究中将电极内液的游离 Ca2+浓度设定为1 000 nmol/L，以最大限度地保证SK通道激活。形成全细胞封接状态后，将细胞钳制在－55 mV，给予指令电位从－100 mV～+80 mV，步长20 mV，波宽为500 ms的刺激。记录用药前电流后，用含SK通道特异性阻断剂蜂毒明肽(100 nmol/L)的电极外液灌流3 min，再次记录电流，给蜂毒明肽前后的电流相减获得“蜂毒明肽敏感性电流”，此电流即“IK，Ca”。记录每个细胞电容，计算电流密度(pA/pF)=电流(pA)/电容(pF)。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件。数据以±s表示，组间数据比较采用Student's t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

全部犬顺利完成实验，每只犬至少取3个心房肌细胞进行膜片钳实验。当钳制电位为－100 mV时，快速心房起搏组心房肌细胞电流密度为(－1.7±0.3)pA/pF，对照组为(－0.7±0.1)pA/pF，P ＜0.01;+80 mV时，快速心房起搏组心房肌细胞电流密度为(4.1±0.6)pA/pF，对照组为(－1.6±0.2)pA/pF，P ＜0.01。

3 讨论

SK通道家族的特性是电压非依赖性、仅由细胞内的Ca2+激活和可被蜂毒明肽特异性阻断，蜂毒明肽对SK通道有高度选择性，对其他离子通道则不敏感［5］。

SK通道是细胞内的钙调控和细胞膜的电活动之间的重要功能链接［6］。AF的发生、发展与离子通道表达异常和细胞内的钙调控失常密切相关［7］。Li等［8］发现，SK2基因敲除小鼠的心肌细胞动作电位延长，更易于诱发 AF。Ellinor等［9］发现，人类1q21位点的KCNN3(SK3)基因多态性与孤立性AF的发生相关。最近3项动物实验［10～12］结果显示，阻断SK通道可以中止AF的发作，提示SK通道可能是一种新型的AF相关性离子通道［13］。Tuteja等［3］和Xu等［4］的研究证实，SK1和SK2通道呈“心房选择性”分布。该特性使SK通道极有可能成为新的“选择性”治疗AF的药物靶点［14］，即特异性阻断SK通道的药物可以有效治疗或预防AF，且无其他抗心律失常药物常见的致室性心律失常的风险。

我们的前期实验［1］已经证实，慢性AF(AF维持阶段)患者心房肌细胞中IK，Ca电流密度减低、SK1和SK2表达下调。但Nagy等［15］报道，在生理状态下，大鼠、犬和人心室肌细胞的SK2通道处于失活状态，对动作电位的复极化过程不产生影响。Ozgen等［16］的研究显示，短时间(3 h)快速起搏(模拟AF早期阶段)可使兔肺静脉肌袖细胞IK，Ca电流密度增强，SK2亚型表达增加，但该研究是在离体组织模型上进行的。本研究采用活体犬AF模型，结果显示IK，Ca电流密度在AF早期阶段增强。该结果与Nagy等［15］的研究结果吻合。这说明SK通道在AF的不同时期功能变化不同，即SK通道在AF初始(早期)阶段和维持阶段(慢性AF)呈“矛盾性重构”改变。

综上所述，SK通道的功能上调是AF初始阶段的重要分子机制之一。由此推测，未来开发新型的特异性SK通道阻断剂，并预防性应用于AF高危人群中，可能大大降低AF的发生率。

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