改良线栓法制备大脑中动脉栓塞动物模型的效果观察

孙长青，贺 玮，李伟光，李志慧，张成岗

(1天津医科大学宝坻临床学院天津市宝坻区人民医院，天津301800;2军事医学科学院放射与辐射医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，全军军事认知与心理卫生研究中心)

据统计，80%的卒中是由于大脑中动脉供血区域的缺血性破坏导致［1～3］。脑缺血损伤动物模型是研究脑血管疾病损伤机制和防治措施不可缺少的工具［4，5］。大脑中动脉栓塞(MCAO)［6］是卒中研究领域常见的模型制备方法［7］，目前最常用的是线栓法［8，9］。线栓法制备的卒中动物模型神经病理和认知障碍损伤程度均相对较轻，适合作为脑血管疾病动物模型。2012年9月～2013年6月，我们使用体视显微镜、显微镊子和留置针对传统线栓法进行改良，观察改良线栓法制备脑缺血损伤动物模型的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年SD大鼠60只，体质量250～300 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。模型制作前12 h禁食不禁水，随机分为改良组(改良线栓法)和传统组(传统线栓法)，每组30只。

1.2 材料 器械:麻醉机(美国Midmark公司);体视显微镜(天津医用光学仪器厂);显微外科手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂);自制金属拉钩;一次性使用静脉留置针(威海洁瑞医用制品有限公司);麻醉剂异氟烷(上海雅培制药有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 传统线栓法［10］10%水合氯醛腹腔注射麻醉传统组大鼠后，颈部手术区备皮、消毒，颈部正中切口;右侧颈动脉鞘处分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎翼腭突动脉、颈外动脉及颈总动脉。在颈总动脉结扎处远心端剪一斜切口，插入栓线;进线17～21 mm时，感到明显阻力，证明栓线头端已达大脑中动脉起始处;在颈总动脉插口结扎固定栓线，逐层缝合。

1.3.2 改良线栓法 改良组大鼠麻醉(麻醉机)后，平卧固定于手术台，颈部用碘伏原液进行消毒，旁正中切开，切口长2～4cm;分离肌肉后可见到颈动脉，通过自制拉钩牵拉皮肤和肌肉以完整暴露手术视野;体视显微镜下操作，轻柔分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，勿伤及迷走神经;结扎颈外动脉，并在颈总动脉近心端结扎颈总动脉，同时在颈总动脉下备线，然后用动脉夹夹闭颈内动脉;显微镊子末端置于颈总动脉结扎和备线部位之间的下方，使用一次性静脉留置针将显微镊子两末端上的颈总动脉刺破一孔，可见血液流入留置针内;显微镊子不动，撤掉留置针，将大鼠用线栓沿刺破的颈总动脉孔插入颈总动脉，并用弯头眼科镊将尼龙线栓经颈内动脉进入颅内推送至大脑中动脉开口处，以阻断大脑中动脉血流;尼龙线栓插入深度为从颈总动脉分叉部起18～20 mm，并用颈总动脉下的备线结扎，以防线栓拔出，然后剪掉多余线栓并缝合切口。术后大鼠置于安静温暖处饲养。参照Zea Longa评定进行神经功能缺损程度的评价:0级为无缺陷;1级为不能伸展对侧前肢;2级为对侧前肢屈曲;3级为轻度向对侧转圈;4级为严重的转圈;5级为对侧瘫痪。3～4级为模型制作成功。

1.3.3 观察指标 比较两组造模成功率、手术时间、术中出血量及神经损伤情况。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验;计数资料采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

改良组失败1只、死亡2只、成功27只，成功率90.00%(27/30);传统组失败4只、死亡6只、成功20只，成功率66.67%(20/30);两组成功率比较，P＜0.05。改良组神经损伤1只(3.70%)，传统组5只(25.00%)，P ＞ 0.05。改良组手术时间(24.04±2.87)min，传统组(49.95±5.79)min，P ＜0.01。改良组术中出血量(1.79±0.72)mL，传统组(3.53±1.07)mL，P ＜0.01。

3 讨论

线栓法制备的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型［9］，是模拟缺血性卒中患者最常见的动物模型，具有创伤性小、缺血效果肯定、重复性好、无需开颅、可准确控制缺血及再灌注时间、大脑中动脉闭塞及再灌注效果好等优点［11，12］。传统线栓法制备MCAO模型是提拉颈总动脉下的备线用剪刀剪破［13，14］，或者用注射器针头刺破颈总动脉和进行线栓插入，手术操作在肉眼下进行。使用剪刀剪破血管时，在动脉上剪口不易控制口径大小;口径边缘锐利，提拉时容易断开;很容易剪断血管;即使剪得很好，但由于血液流出而导致血管塌陷，在插入线栓时还需要花费一定时间才能找到管腔;导致MCAO模型不易成功。而采用注射器针头刺破血管的方法很容易把整个血管都穿透，甚至穿断。使用留置针代替注射器针头进行操作时，由于留置针的末端比针头斜面短很多，但锐利程度相同，很容易进入血管腔而不穿透血管，而且留置针末端进入血管后很快看见血液流出，此时血管的破孔直径可以让线栓顺利进入，同时也能够防止留置针继续向血管腔内进入。初做MCAO模型的人对于颈内外动脉的区分往往有一定困难，通常可根据血管的命名来判断，即颈内动脉在后外侧，颈外动脉在前内侧;还可根据颈内动脉和迷走神经包裹在动脉鞘内来判断，也就是说与迷走神经伴行的血管一定是颈内动脉。

改良线栓法中使用体视显微镜和留置针等技术，操作更快、更容易，模型成功率更高。该方法的优点包括:①全程在体视显微镜下操作，使血管和神经甚至分支都看得非常清楚，避免了人为损伤。在使用体视显微镜之前，MCAO模型制作中曾经出现过模型虽然成功但是大鼠的气管却总是发出“吼吼”的声音，后经检查，发现其原因是损伤了迷走神经或其分支，尤其在夹闭颈内动脉时一些细小的神经肉眼是看不到的，或者因为视野受限将未看见的神经部分一起夹闭。在使用体视显微镜操作后上述现象极少出现。本研究改良组1只大鼠发生神经损伤，是因为在分离神经和血管时镊子末端不圆顿而损伤神经所致。我们的结论虽然两组在神经损伤上差异没有统计学意义，但如果排除这1只器械原因引起损伤外应该还是具有统计学差异的，所以结论上我们认为改良方法可以减少神经损伤的发生。②在体视显微镜下植入线栓时可以清楚地看见线栓进入颈内动脉以及进入标志处，使手术更加容易。③自制拉钩的应用使手术视野暴露得非常好，但是由于肌肉具有弹性，必须让拉钩能刚刚阻挡住肌肉回缩即可，牵拉强度不能太大，以免损伤其他组织。④在进行血管刺破时，使用镊子固定血管代替丝线牵拉。镊子固定血管非常稳固，血管不会滑动，也不会翻动，节省时间;丝线牵拉很容易出现血管滑动和翻动，不利于后面的操作。⑤插入线栓时仍需要将镊子置于原来的位置不动，一方面血管不动容易看见其上面的破孔，有利于线栓的进入;另一方面，镊子的末端由两个分叉组成，远心端的分叉还能起到阻断血流、止血的作用，减少出血的几率。

本研究改良组造模成功率明显高于传统组，神经损伤、手术时间、术中出血均少于传统组。造模成功率提高除了与应用显微外科技术有关外，还与术者手术经验和技术水平有关，所以要求进行此模型制作的人员应先进行外科操作方面的培训，以进一步提高造模成功率。

［1］Sousa LF，Coelho FM，Rodrigues DH，et al.Blockade of CXCR1/2 chemokine receptors protects against brain damage in ischemic stroke in mice［J］.Clinics(Sao Paulo)，2013，68(3):391-394.

［2］Ansari S，Azari H，Caldwell KJ，et al.Endothelin-1 induced middle cerebral artery occlusion model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in rat［J］.J Vis Exp，2013，16(72):pii50014.

［3］Rousselet E，Kriz J，Seidah NG.Mouse model of intraluminal MCAO:cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining［J］.J Vis Exp，2012，6(69):4038.

［4］Yushmanov VE，Yanovski B，Kharlamov A，et al.Sodium mapping in focal cerebral ischemia in the rat by quantitative(23)Na MRI［J］.J Magn Reson Imaging，2009，29(4):962-966.

［5］Zu QQ，Liu S，Xu XQ，et al.An endovascular canine stroke model:middle cerebral artery occlusion with autologous clots followed by ipsilateral internal carotid artery blockade［J］.Lab Invest，2013，93(7):760-767.

［6］Shmonin A，Melnikova E，Galagudza M，et al.Characteristics of cerebral ischemia in major rat stroke models of middle cerebral artery ligation through craniectomy［J］.Int J Stroke，2012.［Epub ahead of print］

［7］Zhu S，Li Y，Lu H，et al.Imaging the early cerebral blood flow changes in rat middle cerebral artery occlusion stroke model［J］.Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc，2012(2012):2655-2658.

［8］Kollmar R，Schabitz WR，Heiland S，et al.Neuroprotective effect of delayed moderate hypothermia after focal cerebral ischemia:an MRI study［J］.Stroke，2002，33(7):1899-1904.

［9］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［10］杨其侠，秦浩，郝伟，等.激动GHB受体对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制探讨［J］.山东医药，2013，53(4):14-16.

［11］Liu S，Zhen G，Meloni BP，et al.Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials(1st edition)［J］.J Exp Stroke Transl Med，2009，2(2):2-27.

［12］Rousselet E，Marcinkiewicz J，Kriz J，et al.PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke［J］.J Lipid Res，2011，52(7):1383-1391.

［13］肖爱娇，陈日新，康明非.脑缺血再灌注损伤模型大鼠大脑皮质细胞色素C与Bax蛋白的表达［J］.南昌大学学报(医学版)，2013，53(2):10-13，30.

［14］陈卫银，孙承铭，王会民，等.丹参酮ⅡA预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经保护作用及GFAP表达的影响［J］.山东医药，2011，51(8):35-37.