建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

张余兵

·论著·

建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

张余兵★

目的为HBV突变检测建立一种有效、快速、简捷的蝎子实时荧光PCR新方法。

HBV；蝎子实时荧光PCR新方法；Sanger测序法

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界性公共卫生主要疾病之一，其传染性是艾滋病毒的50至100倍［1-2］。全世界有约20亿曾经或正在感染HBV病毒的人，其中属于慢性感染的有3．5～4．2亿［2-3］。中国是乙肝大国，肝病毒携带者约为1亿，被世界卫生组织划入了HBV感染高流行区［2-3］。

HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，只对肝脏“情有独钟”。HBV感染的主要临床结果是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌［4-6］，估计每年有60万人死于由HBV感染引起的疾病［2，7］。有研究显示，我国有80％以上的原发性肝癌都与HBV感染有关［8-9］。

目前临床上用于抗病毒治疗的两类主要药物是核苷（酸）类似物和干扰素类药物（如a-IFN）。其中核苷（酸）类药物与HBV DNA聚合酶的自然底物（三磷酸脱氧核苷）竞争性地同该酶结合，从而使HBV DNA合成终止，达到抑制HBV复制的目的。这类药物的疗效显著，但会因为长期用药而导致耐药性问题。阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）是目前在我国上市应用于临床抗HBV药物的核苷（酸）类似物，也是我国临床治疗中应用最多的抗HBV药物之一。患者长期服用ADV会有较高耐药率的发生，在接受阿德福韦酯治疗1、2、3、4、5年HBV累积耐药率分别为0％、3％、11％、18％、29％［10］。其中rtAl8lV和rtN236T是经典的ADV耐药突变形式［11-12］，rtN236T是HBV的第236位点的AAC突变为ACC，即天冬氨酰被苏氨酸替代。

本文采用蝎子实时荧光PCR新方法，该方法采用的是引物前端针对突变位点设计，末端形成蝎子结构，只能扩增突变模板，不能扩增野生模板，能检测HBV的rt236位点，判断其是否发生rtN236T突变。通过与传统的Sanger测序法进行比较，确定其灵敏度和特异性。该方法的建立，能更好地指导患者临床用药。

1 材料与方法

1．1标本来源

收集2013年11月至2014年2月间的HBV患者的血清157例。其中男性患者93例（59．24％），女性患者64例（40．76％）。年龄范围从25至50岁，男性患者30±5．6岁；女性患者32±7．6岁，标本均为南平人民医院的检验科存档样品。

1．2主要仪器与试剂盒

1．2．1主要仪器

ABI 7500实时荧光定量PCR仪，ABI 9700实时荧光定量PCR仪。

1．2．2主要试剂盒

中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取试剂盒（离心柱法）。

1．3方法

1．3．1HBV病毒DNA提取

采用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取试剂盒（离心柱法），按试剂盒说明书操作，提取HBV病毒DNA，提取后放置于-20℃保存备用。

1．3．2引物设计

针对HBV的相对保守序列，用Primer Express 5．0软件为HBV基因设计引物和探针。分别为HBV-F1：5′-ATACCATCACTATAAGTGGTATAC ATTTAAC-3′；HBV-P1：5′-CTAACAAAACAAAG AGATGGGGTTACTCTCTG-3；HBV-F2：5′-ACTG TTTGGCTTTCAGTTATATGGAT-3′；HBV-R1／2：5′-TGTGTTCTTGTGGCAAGGA-3′。其中HBV-F1、HBV-P1和HBV-R1／2是蝎子实时荧光PCR新方法检测HBV的rtN236T突变的引物探针；HBV-F2和HBV-R1／2是Sanger测序法的引物。

1．3．3蝎子实时荧光PCR新方法检测

在蝎子实时荧光PCR新方法中，设计的蝎子引物（HBV-F1）是针对发生了rtN236T突变的HBV基因设计的，其5′端有15个碱基跟模板不匹配，但其最末端会跟引物自身匹配，从而形成一个蝎子结构；3′端则是针对HBV基因发生了rtN236T突变设计的。这套引物探针能特定地将HBV突变型rtN236T扩增出来，但不能将HBV野生型基因扩增出来（见图1）。

在7500实时荧光定量PCR仪对HBV病毒DNA进行荧光定量PCR。反应条件：95℃15 min；94℃15 s；55℃50 s，40个循环。对结果进行分析：对一个标本，若是有荧光曲线，则此标本为HBV的rtN236T突变型；反之，若没有荧光曲线，则此样本为HBV野生型（见图2）。

1．3．4Sanger测序法检测

首先是用引物HBV-F2和HBV-R1／2在ABI 9700 PCR仪进行HBV的目的基因PCR扩增。接着是在PCR扩增结束后，取5 μL PCR产物进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，观察是否在204 bp处有目的条带。第三步是若看到有明显的单一目的条带，则纯化回收PCR产物。最后是在3500xL Genetic Analyzer上进行测序PCR，然后利用ABI公司Sequencing Analysis软件进行数据收集和分析。

图1 蝎子引物的作用示意图Figure 1The diagram of the Scorpion PCR primers

图2 样本类型Figure 2Types of samples

1．4两种方法灵敏度的检测

先将HBV野生型病毒核酸和rtN236T突变型核酸两者稀释至同一浓度：1 ng／μL。然后，以不同的比例（100％、50％、10％、5％、1％、0％）混合两者，作为PCR模板，分别用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法进行检测。

1．5两种方法对157例HBV感染患者的DNA的检测

同时用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法对157例HBV感染患者的DNA进行检测，并统计分析数据，用Kappa检验进行检测方法一致性分析。统计软件为SPSS15．0数据包。

2 实验结果

2．1两种方法灵敏度的比较

在混有不同比例HBV突变型rtN236T基因的样本中，蝎子实时荧光PCR新方法能检测出含5％rtN236T突变型的样本，也即灵敏度达5％（见图3），而Sanger测序法的灵敏度为10％～20％，所以蝎子实时荧光PCR新方法的灵敏度比传统的Sanger测序法更高。

2．2蝎子实时荧光PCR新方法

在157例HBV患者血清标本中，共检测到HBV基因rtN236T突变型69例。

2．3Sanger测序法

在157例HBV患者血清标本中，共检测到HBV基因rtN236T突变型68例（见图4）。

2．5两种方法检测结果比较

同时对蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法的检测结果进行四格表统计（见表1）。Kappa检验进行检测方法一致性分析，经SPSS 15．0软件统计分析结果显示，Kappa＝0．991，P＜0．001，一致性好。

图3 蝎子实时荧光PCR新方法的灵敏度Figure 3 The sensitivity of Scorpion real-time PCR method

图4 Sanger测序法的测序结果Figure 4The sequencing results of Sanger sequencing method

3 讨论

乙型肝炎病毒感染是一个全球性公共卫生问题，人类慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生都与它有着密不可分的关系。目前，世界上有约20亿人口曾被HBV感染或正在感染HBV病毒，有约3．5亿人变成慢性感染者，每年因为HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌而死亡的人在50万至120万，全球肝癌患者中75％以上是由HBV感染所致［13］。中国是乙肝大国，现有HBV携带者约一亿。

表1 蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法检测结果Table 1The detective results of Scorpion real-time PCR method and Sanger sequencing method

HBV是一种嗜肝的小DNA病毒，它的基因组总长度约为3．2 kb，为部分双链DNA结构，其负链包含完整的HBV基因组，而与之互补的正链的长度是不固定的。目前在中国临床上用于抗HBV的最多的药物之一就是ADV，但长期服用该药物，有一定的概率产生耐药性。其中，最经典的ADV耐药突变形式就是rtN236T。因此，检测HBV基因是否发生rtN236T，有很大的意义，能实现患者个体化用药，让患者得到更有效、更低毒副作用的治疗。

本文同时用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法对157例HBV患者的HBV基因的第236位点进行检测，对比结果发现，两者在检测到rtN236T突变上达到98．6％的符合率。用SPSS 15．0统计软件进行统计分析，两种方法检测比较采用配对卡方检验做统计学处理，经SPSS15．0软件统计分析结果显示，Kappa＝0．991，P＜0．001，一致性好。可能是蝎子实时荧光PCR新方法较Sanger测序法灵敏，在检测HBV基因rtN236T突变上，蝎子实时荧光PCR新方法比Sanger测序法多检测出1例突变标本，这需进一步验证。

从灵敏度上来看，蝎子实时荧光PCR新方法能检测出低至混有5％HBV基因rtN236T突变型核酸的样本，即灵敏度达5％，而Sanger测序法只能达到10％～20％，这说明蝎子实时荧光PCR新方法更有优势。

从这两种方法对比中，可以发现：Sanger测序法可以检测到引物所覆盖的范围内的潜在突变位点，而蝎子实时荧光PCR方法只能检测到一个特异的位点。但蝎子实时荧光PCR新方法用的时间远远比Sanger测序法短，其采用96个孔板的实时荧光PCR仪，在2个小时内能得出九十多个样本的结果；而Sanger测序法还需将PCR产物进行纯化回收、测序仪上机、利用Sequencing Analysis软件分析才能得出结果，操作繁琐、耗时、耗力、容易出差错。故选择方便、迅速、有效的蝎子实时荧光PCR新方法判断HBV基因是否发生rtN236T突变，能更好地指导HBV患者更好地用药，进行个体化治疗。

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Establishment of a new Scorpion real-time fluorescence PCR method to detect the mutation of HBV

ZHANG Yubing★
（Clinical Laboratory，The Nanping Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Nanping，Fujian，China，353000）

ObjectiveTo establish an effective，rapid and simple Scorpion real-time PCR method to detect the mutation of HBV．MethodsThe rtN236T mutation of HBV was detected by Scorpion real-time PCR and Sanger sequencing method，respectively．157 patients were tested and coincidence rate was calculated．The samples which mixed with different proportions of HBV mutant DNA were tested to compare the sensitivity of Scorpion real-time PCR method and Sanger sequencing method．ResultsIn the DNA of 157 HBV patients，69 cases with the rtN236 mutation of HBV were detected by Scorpion real-time PCR method while 68 cases were detected by Sanger sequencing method．The coincidence rate of the two methods was 98．6％．The Scorpion real-time PCR method can detect the samples which mixed with 5％HBV mutant DNA，and its sensitivity was 5％，which was higher than that of Sanger sequencing method．ConclusionThe mutation of HBV can be detected by the Scorpion real-time PCR．It is more simple，convenient，high sensitivity than Sanger sequencing method．Scorpion real-time PCR method is suitable for clinical applications．

HBV;Scorpion real-time PCR method;Sanger sequencing method

国家科技部“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项”（2008ZX10003-012）

福建中医药大学附属南平人民医院检验科，福建，南平353000

★通讯作者：张余兵，E-mail：zyb200612＠163．com

方法同时用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法对比：对157例HBV患者的血清的DNA进行HBV基因rtN236T突变检测，统计其符合率；通过对混有不同比例的HBV基因rtN236T突变核酸的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度。结果在157例HBV患者的血清样本中，蝎子实时荧光PCR新方法检测到rtN236T突变的有69例，而Sanger测序法检测的有68例，其符合率为98．6％；蝎子实时荧光PCR新方法能检测出混有5％突变的样本，其灵敏度达5％，比Sanger测序法高。结论蝎子实时荧光PCR新方法能有效检测到HBV突变，且比Sanger测序法更为简单、快速、灵敏度高，适合临床应用。