联合应用常染色体STR、X-STR和线粒体SNP鉴别缺失双亲姐妹同胞关系

王晓勋陈敏李瑞明贺娇王彦涛罗银州

·论著·

联合应用常染色体STR、X-STR和线粒体SNP鉴别缺失双亲姐妹同胞关系

王晓勋1★陈敏2李瑞明1贺娇3王彦涛4罗银州4

目的对双亲缺失的姐妹进行同胞鉴定。方法采用chelex-100法提取血液DNA，通过检测常染色体短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点、X染色体STR位点和线粒体单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行基因分型，分型结果通过判别函数、ITO法、X染色体STR位点和线粒体SNP分析的方法进行同胞关系判定。结果39个常染色体等位基因位点的共享基因数为27个，用辨别函数判别归于无关个体；用ITO法计算亲缘关系系数（FSI）为6．95003×10-44，判别为无关个体；12个X染色体STR等位基因位点中，有3个X染色体STR位点不匹配，排除姐妹俩来自同一父亲；线粒体SNP的检测显有3个基因座不同，两人来源于不同母系。结论通过联合利用常染色体STR、X染色体STR和线粒体SNP检测技术进行确认两人不是同胞姐妹关系。

亲权鉴定；同胞关系鉴定；法医遗传学

父母缺失的同胞鉴定，除有较多同胞兄弟姐妹，可以依据同胞个体来重塑其父母的等位基因型［1-2］。但在特殊情况下，仅有两人，没有其它兄弟姐妹情况下，就没有办法更准确的重塑生父母的等位基因型，必须依据性别的不同，需要利用常染色体，X染色体或Y染色体STR（short tandem repeat，STR）以及线粒体位点的匹配情况进行判断［1-2］。常染色体用于同胞亲缘关系的鉴定已经报道很多［1-2］。判别函数法的平均错判率较高，特别对于共享基因得分在判别函数辨别点附近的样本显出更高的错判率［1-2］，实际应用中已经得到证实。所以增加检测更多的常染色体STR等位基因座等位基因的检测。利用ITO法［3］得到亲缘指数、以及依据案例实际情况的不同加做X染色体、Y染色体以及线粒体位点的检测可以更可靠明确判断，被广泛应用于法医亲权鉴定领域［3-5］。本文阐述了联合利用常染色体、X染色体和线粒体SNP这些检测方法来判别父母缺失，无其它同胞个体之间进行同胞亲缘关系鉴定。

案情简介：一女士（李）要求与另一女士（吴）进行全同胞鉴定。叙述两人来自共同的父母，多年前由于家庭困难，父母送其妹妹给别人家抚养。以后没有任何联系，吴女士自叙年龄和其送出去的妹妹一致，送出地点和发现地点也很吻合，李女士和吴女士相貌相似（有照片和她们之间的叙述为证）。自叙她们一起去看牙齿，牙医叙述其牙齿周围结构也很一致。并说明除她们以外没有其它同胞兄弟姐妹。

1 材料和方法

1．1样本

抽取两人耳垂血，分别编号用于同胞鉴定。标本一：李女士血液；标本二：吴女士血液。

1．2试剂和仪器

美国应用生物有限公司ABI AmPISTR® Identifiler®试剂盒、中德美联AGCUExpressmarker22试剂盒、AGCU Expressmarker 21+1试剂盒、AGCU X12 STR试剂盒。AGCU Mitochondria l SNP试剂盒。美国ABI 310遗传分析仪，PE公司PE9600扩增仪。EPPENDORF离心机。

1．3方法

等位基因座的各等位基因的分型采用常染色体试剂盒。收集血液标本，用chelex法提取DNA，定量后用于复合PCR扩增。采用的试剂盒是AmPISTR Identifiler试剂盒、AGCU Expressmarker22试剂盒、AGCU Expressmarker21+1试剂盒用于常染色体STR检测。X染色体STR采用AGCU X12 STR试剂盒，用于对两个自称姐妹进行X性伴随染色体线粒体的检测来判断是否来自同一父系。对判断是否来自同一母系，采用AGCU Mitochondrial SNP试剂盒，反应体积12．5 μL，PCR反应条件参考各试剂盒说明，甲酰胺猝冷变单链，ABI 310 ABI3500DX毛细管电泳。收集数据，应用相应的分析软件collection3．0收集电泳数据，genemap3．1完成位点和等位基因座等位基因的分型。

2 结果

2．115个常染色体STR等位基因座等位基因分型结果

如表1所示，根据Identifiler试剂盒检测的两位女士的常染色体STR分型结果，15个STR等位基因座中两人具有的共享基因数是7个。依据我们建立的本系统的判别函数判别为无关个体组，此判别函数平均错判率为0．0298。

2．224个常染色体等位基因座等位基因分型结果（除表一外的等位基因座）

如表2所示，AGCU Expressmarker22试剂盒、AGCU Expressmarker21+1试剂盒共计检查39个常染色体STR位点，1个性染色体STR位点。除与ABI AmPISTR Identifiler试剂盒相同外的所有常染色体STR等位基因座位点。全部39个常染色体STR基因座共检测状态一致性等位基因（共享基因）共27个，19个必检基因座加10个补充的STR基因座共18个状态一致性等位基因（共享等位基因），（Identity by state score，IBS）（18）﹤21，倾向于两女士为无关个体。

2．312个X染色体STR基因座等位基因分型结果

如表3所示，两女士使用AGCU X12 X-STR试剂盒进行X染色体STR分型，有DXS981、DXS6789、DXS10不匹配，不符合孟德尔遗传规律，排除两女士来自同一父亲。

表1 ABI AmPISTR Identifiler试剂盒分型结果（a／b，a，b为等位基因位点）Table 1Genotyping results with ABI AmPISTR Identifiler box（a／b，a and b are Allelic loci）

表2 AGCU Expressmarker22试剂盒、AGCU Expressmarker21+1试剂盒联合联合分型结果Table 2 Genotyping results with AGCU Expressmarker22 and AGCU Expressmarker21+1 box

表3 AGCU X12 X-STR试剂盒检查X染色体试剂盒12个STR位点Table 3 12 STR loci on X-chromosome with AGCU X12 X-STR box

2．4荧光标记的线粒体SNP位点检测试剂盒检测结果

本实验应用中德美联AGCU Mitochondrial SNP试剂盒检测了59个线粒体SNP位点分型信息，结果发现两人补充位点共有3个线粒体SNP基因座不同：李女士于16319位点为A，8794位点为T碱基，16126位点为C碱基；吴女士16139位点为G，8794位点为C，16126位点为T碱基。查阅人类线粒体进化树，判断李女士归为A5b1单倍群，吴女士不属于A单倍群，显示两位女士的线粒体单倍群不同，此两女士不是来自同一母系（见图1表4）。

2．5生物学全同胞关系鉴定状态一致性得分（identity by state score，IBS）

如表5显示，19个常染色体位点和19个规定常染色体加10个独立性常染色体等位基因位点以及20个独立常染色体等位基因位点的状态一致性评分（IBS）分别是10、18和27，得分依据规范判断倾向于认为两名被鉴定人为无关个体。

图1 人线粒体进化树SNP位点截图（线粒体单倍群分类）Figure1SNPlociscreenshotofhumanmitochondrial evolutionary tree（classification of mitochondrial haplotype）

表4 线粒体SNP位点分析Table 4Analysis of mitochondrial-SNP loci

表5 生物学全同胞关系鉴定状态一致性得分Table 5Identity by state score（IBS）of virtual full sibling（FS）

3 讨论

父母缺失的同胞鉴定，一直以来鉴别起来比较繁琐，常用的方法就是收集兄弟姐妹的血液进行常规父母染色体STR等位基因分型重塑，推断其共同生父和生母的STR等位基因型用于同胞的亲缘鉴定，虽然此法可以推断共同生母和生父的基因型，但需要有较多的同胞兄弟姐妹为前提，当子代仅限于两人的情况下，获得共同生母生父的常染色分型就变得异常困难，就需要进行常染色体共享基因法和亲缘关系的ITO法来判别两人归属［3，5］。由于共享基因法是依据判别函数来进行判别，特别在所用常染色体等位基因座数目不充分时，其判别的平均错判率比较高，特别是在判别点周围错判率更是远远高于平均错判率。在司法部没有颁布生物学全同胞关系鉴定实施规范之前各实验室采用的判别方法不同（采用的常染色体等位基因座类型不同、数量不同）。在规范发布前用共享基因法来判别同胞关系中，由于用15常染色体等位基因座建立的判别函数来判别结果被错判的平均概率为2．98％。仅依据此判别函数判断结果有一定的风险［5-8］。

ITO法需要检测更多的常规染色体STR才能得到比较可靠的结论［3］，除此之外依据性别的不同可以加做X或Y染色体STR的检查，必要的时候还需要进行线粒体位点的检查以便支持和验证上叙判别结论。本文中两女性共同叙述父母皆离世，没有其它兄弟姐妹。并且看似相貌类似，共述年龄与当年送养时期推算的年龄一致，送养地点记忆也很同一，并且其自叙两人一起看牙医，牙医说两人牙齿结构都很相似等支持两女士为同胞姐妹的供述。

本文用ABI AmPISTR Identifiler试剂盒对两人的常染色体进行了分型，其共享基因数为7，用判别函数进行归类判别，此两女性个体被归于无关个体，与上述两人描述产生了矛盾，考虑到15个等位基因座判别函数的平均错判率为2．98％。逐增加常染色体STR等位基因分型的检查，加做AGCU Expressmarker22试剂盒、AGCU Expressmarker21+1共计除ABI AmPISTR Identifiler试剂盒里15个STR外的24常染色体STR，总计有39个常染色体STR基因座，在总共39个常染色体等位基因位点的共享基因数为27个。得到的分型结果用ITO法进行亲缘关系系数（FSI）的计算。其两个个体39个常染色体等位基因座分型累积亲缘关系指数计算为6．95003×10-44［3］。可以判别为无关个体，为了使得共享等位基因法判别函数和ITO法判断的结果得到进一步证实。继续进行X染色体STR和线粒体SNP位点检测。如果两人系同一父亲，其来自父系的X染色体单倍体等位基因座分型结果应该相同（在排除突变的情况下）［4-5］。

由于两姐妹父母早年已逝，两人对父母生活的实际情况未必能完全了解，所以应该排除其是同母异父的半同胞的可能性。对两人进行X染色体12个STR等位基因座分型检测，所用试剂为AGCU X12 X-STR试剂盒。结果见表3。有三个等位基因座等位基因分型不符合孟德尔遗传规律［6，9-11］。考虑到DXS6789基因座分型结果超越了一个重复序列，并且有3个位点的不符合，可以排除两人系同一父亲。

由于自称姐妹的两人，长相近同，且都像她们印象中的母亲，所以为了更进一步确认两人是否为同母异父同胞，加做线粒体SNP位点分型。所用试剂为AGCU Mitochondrial SNP试剂盒。结果见表4。结果显示HEX色线粒体SNP位点信息完全一致。TAMARA色及FAM，HEX补充位点共有3个基因座单核苷酸不同。李女士于16319位点为A，8794位点为T碱基，16126位点为C碱基，故归为A5b1单倍群；结果见图1。对应的吴女士16139位点为G，8794位点为C，16126位点为T碱基。因此排除2个样本来自同一母系。结论排除吴女士和李女士是同胞姐妹关系［7-8］。

关于同胞鉴定司法部颁布的生物学全同胞关系鉴定实施规范，对全同胞的司法鉴定做了全面的阐述，我们应用这一规范，在此规范的范围内利用状态一致性评分（IBS），用三种不同数目等位基因座记分系统进行积分，结果见表5，在规定的19个常染色体位点和19个规定常染色体加10个独立性常染色体等位基因位点的状态一致性评分（IBS）分别是10和18，得分依据规范判断倾向于认为两名被鉴定人为无关个体。与以上得出的最终结论一致。本实施规范定义的生物学全同胞关系特指在双亲皆无情形下甄别全同胞和无关个体两种检验假设。鉴定人应详细了解两名被鉴定人间是否存在其它可能的亲缘关系，若两名被鉴定人间存在其他亲缘关系（如半同胞、堂表亲等），则本实施规范不适用［12-15］。所以在结论与先前的陈述思维和观察结果不一致，不能确定是否为同父的情况下，本文联合对自称是全同胞姐妹两人进行常染色体、X染色体STR等位基因位点以及线粒体SNP位点进行联合检测，依据常染色体STR共享基因判别式得出的结论。后面利用X染色体和线粒体SNP位点从父系、母系的两个方面进行论证得出结论。最后再用司法部颁布的生物学全同胞关系鉴定实施规范的方法进行验证。

4 结论

全同胞鉴定常染色体STR依据判别函数判别在判别点周围有比较高的错判率，应该严格依照司法部颁布的生物学全同胞关系鉴定实施规范的方法进行验证，在不能确定同父同母的情况下，特别是当先前的观察和调查与所做的结论不一致时，联合利用X、Y、线粒体测序等检测手段得出结论是必要的，应该引起鉴定人的重视。

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[15]中华人民共和国司法部司法鉴定管理局．《生物学全同胞关系鉴定实施规范》司法鉴定技术规范[S]．SF/Z JD0105002．2014．

Identification of the relationship of orphaned sisters by combined using autosomal STR，X-STR and mitochondrial-SNP

WANG Xiaoxun1★，CHEN Min2，LI Ruiming1，HE Jiao3，WANG Yantao4，LUO Yinzhou4
（1．Laboratory of Forensic Evidence，Inspection Department of Taihe Hospital，Shiyan，Hubei，China，442000；2．Sanyan Out-patient Department of Xiyuan Hospital，Shiyan，Hubei，China，442000；3．Second Clinical College，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China，442000；4．Laboratory of Criminal Evidence，Shiyan Public Security Bureau，Shiyan，Hubei，China，442000）

ObjectiveTo carry out a sibling identification on the orphaned sisters．Methods Genomic DNA of two ladies were extracted by using chelex-100 method．Genotyping was performed by detecting STRs loci on autosome，STR loci on X-chromosome and mitochondrial-SNP loci．Then the data were analyzed by discriminant function analysis，ITO method，X-STR analysis and mitochondrial-SNP analysis to identify the sibling relation of the orphaned sisters．ResultsThere were 27 shared loci among 39 STRs loci on the autosome，which were considered as unrelated individuals based on discriminant function analysis and ITO method．3 inconsistent loci were detected among 12 X-STR loci，which implied that the two sisters didn’t have a biological father．3 inconsistent loci were detected among 49 mitochondrial-SNP loci，which suggested that they didn’t have a biological mother．ConclusionThe joint use of the technology of autosome STR，X-chromosome STR and mitochondrial-SNP determined that two ladies were not sibling relationship．

Paternity test；Sibling test；Forensic genetics

国家自然科学基金（81171783）

1．湖北省十堰市太和医院检验部法医物证实验室，湖北，十堰442000 2．湖北十堰市西苑医院三堰门诊部，湖北，十堰442000 3．湖北医药学院第二临床学院，湖北，十堰442000 4．湖北省十堰市公安局刑事物证实验室，湖北，十堰442000

★通讯作者：王晓勋，E-mail：524910＠qq．com