非小细胞肺癌EGFR基因突变的临床意义研究*

郑 军 谢贵元 李 姣 罗佳娣 文秋元 范松青

肺癌是导致癌症患者死亡的主要恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌占肺癌80%～85%。尽管手术和放化疗技术不断提高，但非小细胞肺癌患者的5生存率仍低于20%［1-3］。近年来以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为靶点的分子靶向治疗已成为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）一种新的治疗方案，然而只有部分患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）Gefitibib和Erlotinib药物敏感。研究证实：EGFR体细胞突变对Gefitibib和Erlotinib药物治疗后的潜在临床反应起决定作用，EGFR TKI结构域的前4个外显子（外显子18～21）发生突变的患者对Gefitibib和Erlotinib药物的反应性更好［4-6］。本研究检测NSCLC患者EGFR基因突变情况，旨在探讨EGFR突变与非小细胞肺癌临床病理特征的关系，为后续临床的个体化靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

标本来源于湘雅二医院病理科2010年1月至2012年12月期间经肺穿刺（146例）和外科手术切除（68例）的214例非小细胞肺癌患者，全部病例术前未经放化疗。其中男性114例、女性100例，年龄≥60岁为96例、＜60岁为118例，WHO病理组织学分型：肺腺癌185例，鳞状细胞癌29例。本研究经医院伦理委员会审查批准，取得患者同意，符合伦理标准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每一标本从石蜡包埋的肿瘤组织中切取5～6 μm厚的切片，5～10片放入1.5 mL Eppendorf管中，加适量二甲苯进行脱蜡，然后加入适量乙醇洗脱二甲苯，室温或37℃晾干，直到乙醇完全蒸干；加入180 μL Buffer ATL，再加入20 μL蛋白酶K，震荡混匀；56℃消化过夜，直至样品完全裂解；用OIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒提取DNA。

1.2.2 基因突变检测 利用ADx-ARMS®试剂盒（厦门艾德）进行EGFR基因突变检测。

1.3 统计学分析

EGFR基因位点的阳性突变率与肺癌临床病理特征的相关性，利用SPSS 12.0统计软件进行χ2检验或Fisher精确检验，以双侧检验水准P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌EGFR基因突变分析

突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）检测非小细胞肺癌EGFR基因突变。214例非小细胞肺癌EGFR基因总突变率为45.8%（97/214）。其中外显子18突变率为0.93%（2/214）、外显子19突变为22.0%（47/214）、均为缺失突变；外显子20突变率为2.3%（5/214），其中4例为缺失突变，1例EGFR基因T790M突变；外显子21突变率为20.6%（44/214），均为EGFR基因L858R突变；另有2例患者为EGFR基因外显子19和21双重突变（表1）。

2.2 EGFR基因突变情况与患者临床病理特征的关系

EGFR基因在肺腺癌组织中的突变率为50.3%（93/185）明显高于肺鳞状细胞癌17.2%（5/29）（P=0.001）；EGFR基因在女性患者中的突变率57.0%（57/100）高于男性36.0%（41/114）（P=0.002）；EGFR基因突变率与患者的年龄无显著性差异（表2）。

本研究进一步分析68例手术切除的NSCLC的EGFR基因突变与淋巴结转移、肿瘤分化程度和肺癌临床分期的关系。EGFR基因在NSCLC淋巴结转移患者中的突变率（66.7%）显著高于无淋巴结转移患者（39.5%）（P＜0.05），但EGFR基因突变率与NSCLC患者肿瘤分化程度及临床分期均差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表1 214例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分析Table 1 Analysis of EGFR gene mutations in 214 cases of NSCLC

表2 EGFR基因突变与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系Table 2 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features of NSCLC

表3 EGFR基因突变与68例手术切除非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系Table 3 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features in 68 cases of surgically resected NSCLC

3 讨论

EGFR是一种跨膜受体型酪氨酸激酶，在NSCLC中存在过表达和（或）发生突变。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib为进展期NSCLC的临床一线用药，肺癌患者EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）靶向治疗的一个必要前提条件［4-5］。目前，突变扩增阻滞系统（ARMS）已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法。

EGFR基因突变主要在亚洲、腺癌、女性、非吸烟者占优势，与Gefitinib靶向治疗NSCLC患者的临床疗效分布相似［4］。本研究结果显示，国内NSCLC患者EGFR基因的总突变率（45.8%）与日本、中国台湾及印度地区相接近，明显高于西方人群［6-8］。腺癌是NSCLC最常见的组织类型，本研究中肺腺癌EGFR基因突变率为50.3%（P=0.001），高于韩国［9］（36.4%）和对中国大陆1 195例患者评估中肺腺癌EGFR基因突变的检出率（38.1%）［10］。这可能与ARMS方法检测灵敏度高，而且可以对原来未能检测出阳性结果的小样本增加检出率有关。性别是NSCLC中EGFR基因突变的临床预测因素之一，本研究结果与亚洲和西方国家的研究报道相一致，女性同样有较高的突变率［6-10］。本研究进一步证实亚洲腺癌患者和女性非小细胞肺癌EGFR的突变率总体较高，是EGFR-TKI靶向治疗的优先人群。

EGFR基因共28个外显子，其中编码酪氨酸激酶区的是第18～21外显子。研究表明EGFR基因突变部位分散在整个酪氨酸激酶区，19外显子的缺失突变和21外显子的L858R突变是最常见的突变类型［4-6］。本研究结果显示这2个外显子的突变率累计为42.6%。提示19外显子和21外显子易受环境致癌物的攻击，突变后可能进一步激活EGFR信号转导通路，在NSCLC的发生、发展中可能起重要的作用。此外，研究中还观察到2例19外显子的缺失突变和21外显子的L858R突变的双重突变，这一现象提示肺癌患者中也存在EGFR基因联合突变的发生。同时观察到5例罕见的20外显子突变，突变后可能改变了酪氨酸激酶区ATP结合囊的构象，从而增强了ATP与EGFR的亲和性，使肿瘤细胞对EGFR-TKIs产生抵抗性，这一突变主要见于EGFR-TKIs治疗后复发者［9-13］。

药物疗效与肿瘤的淋巴结转移、临床分期及肿瘤病理分级密切相关。多数研究报道显示，EGFR基因在NSCLC淋巴结转移患者中的突变率高于无淋巴结转移患者，而与肿瘤临床分期及病理分级无显著性相关［14-16］。本研究同样发现EGFR基因在NSCLC淋巴结转移患者中的突变率显著高于无淋巴结转移患者，但EGFR基因突变率与NSCLC患者的肿瘤分化程度及临床分期均无统计学意义。这一结果提示Gefitinib可能对EGFR基因突变的不同分化程度和不同临床分期的肺癌患者有同样的药物疗效，本结果需要扩大样本量进一步研究证实。

总之，中国非小细胞肺癌患者EGFR基因突变率较高，肺腺癌是主要的突变类型。检测EGFR外显子19和21突变并结合临床病理特征有望成为评估TKI治疗NSCLC患者疗效的分子标志。

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