miR-19b对巨噬细胞ABCA1表达的影响

吕运成，彭 超，姚 峰，唐艳艳，张 熠，徐 菁，刘政海，唐朝克

(1.南华大学医学院心血管疾病研究所；2.南华大学临床应用解剖研究室，湖南 衡阳 421001；3.南华大学附属第一医院临床研究所)

miR-19b为一种内生性的microRNA，在哺乳动物体内存在两种亚型(miR-19b-1与miR-19b-2)，分别由13号常染色体和X染色体产生，但两者序列完全相同。miR-19b在心肌细胞、单核细胞及血管内皮细胞中均有表达，在人和鼠As斑块中过量表达[1-3]。高脂饮食上调miR-19b表达，促进皮下和内脏脂肪的沉积[4]。这些研究初步提示miR-19b可参与调控脂质代谢，与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的进展密切相关。

生物信息学分析发现miR-19b可靶向结合三磷酸腺苷结合盒转运体A1 (ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)3′ 非编码区(3′ untranslated region，3′ UTR)，且二者结合的自由能较低。人ABCA1 3′ UTR存在三个miR-19b结合位点，鼠ABCA1 3′ UTR存在两个结合位点。这就提示miR-19b可靶向调控细胞内ABCA1表达，而ABCA1介导脂质流出对抑制巨噬细胞内脂质蓄积和AS进展起着关键作用[5]。本研究将采用Western blot、荧光定量PCR等技术检测miR-19b对THP-1源性巨噬细胞ABCA1的mRNA及蛋白水平的影响，证实miR-19b是否调控巨噬细胞ABCA1的表达。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人单核细胞株THP-1购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。RPMI1640培养基购自Solarbio公司，胎牛血清购自杭州四季清生物公司，牛血清白蛋白购自上海生工。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)购自北京诺博莱德公司。miR-19b mimic/inhibitor及riboFECTTMCP转染试剂盒均购自广州锐博公司。ABCA1抗体购自ABCam公司，β-actin抗体购自武汉博士德公司。Trizol及反转录试剂盒均购自Invitrogen公司。荧光定量PCR试剂盒购自康为世纪公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养与转染

THP-1 细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，37 ℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中静置培养。将THP-1细胞种植到六孔板，用160 nM PMA孵育细胞24 h，使其诱导分化成巨噬细胞。实验前制备miRNA转染复合液：miR-19b mimic为250 μL buffer+4 μL mimic+25 μL reagent+1721 μL无血清培养液(mimic终浓度为40 nM)，miR-19b inhibitor为250 μL buffer+8 μL inhibitor+25 μL reagent+1717 μL无血清培养液(inhibitor终浓度为80 nM)。弃去旧培养液后加入转染复合液，转染48h后收集细胞。

1.3 Western blot

收集处理后的细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃离心10 min，弃去沉淀。以4∶1加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100 ℃加热10 min。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，12V恒压半干转膜45 min后，丽春红染色5 min观察转膜效果。5％脱脂牛奶封闭2h，按1∶1000加入羊抗人ABCA1一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，1∶1000 加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗羊二抗，室温孵育2 h，TBST洗3次，用Tanon 5500免疫荧光检测系统激发荧光，Tanon MP软件摄取图像，Tanon CAL软件分析获取各条带的光密度值。

1.4 荧光定量PCR

用trizol试剂分别提取各组细胞的总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，用LightCycler480荧光定量PCR仪进行实时定量PCR，反应体系为50 μL，含2×UltraSYBR Mixture 25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL，buffer 21 μL。95 ℃预变性10 min后，再按95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40个循环。收集60 ℃时的荧光信号。人ABCA1引物为，5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAAT AGTTGT-3′和5′-CCCGGAAACGCAAGTC C-3′。β-actin的表达用作内参照。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-19b对巨噬细胞ABCA1蛋白水平的影响

将THP-1巨噬细胞分为3组：(1)空白对照组，培养液中不加任何其他物质；(2)miR-19b mimic组：培养液中加入40 nM/L miR-19b mimic；(3)miR-19b inhibitor组：培养液中加入80 nM/L miR-19b inhibitor。miR-19b mimic组ABCA1蛋白表达较空白对照组明显降低。miR-19b inhibitor组ABCA1蛋白表达与空白对照组比较明显上调。这就表明miR-19b可抑制巨噬细胞ABCA1蛋白的表达(图1)。

图1 转染miR-19b mimic及其inhibitor 24 h后THP-1巨噬细胞ABCA1 mRNA蛋白表达的变化

2.2 miR-19b对巨噬细胞ABCA1 mRNA水平的影响

将THP-1巨噬细胞分组如上。miR-19b mimic组ABCA1 mRNA水平较空白对照组明显降低。miR-19b inhibitor组ABCA1 mRNA水平与空白对照组比较无变化。这就表明miR-19b可下调巨噬细胞ABCA1 mRNA的水平(图2)。

3 讨 论

巨噬细胞ABCA1的表达水平受到胞内各种调控因子的严密调控[6-7]。本研究采用Western blot和荧光定量PCR检测了miR-19b对巨噬细胞ABCA1蛋白及其mRNA水平的影响，结果发现miR-19b显著抑制巨噬细胞ABCA1的表达。

图2 转染miR-19b mimic及其inhibitor 24h后THP-1巨噬细胞ABCA1mRNA表达的变化

MiR-19在转录后水平抑制巨噬细胞ABCA1的表达。我们在前期的生物信息学分析中发现miR-19b可直接靶向作用ABCA1 3′UTR，且二者结合的自由能较低，这就提示miR-19b可在生理或者病理条件下调控ABCA1的表达。本研究在人源性THP-1巨噬细胞中转染miR-19b mimic与inhibitor，从而增强或抑制miR-19b的功能，结果发现ABCA1蛋白及其mRNA水平均下调。这些结果与生物信息学预测分析一致，并且在体外细胞水平证实了miR-19b对ABCA1表达的调控作用。

miR-19b下调巨噬细胞ABCA1的表达对As的发生发展具有重要意义。ABCA1在介导巨噬细胞内脂质流出及HDL生成中起着关键作用[8]。抑制ABCA1的表达与功能导致巨噬细胞内脂质蓄积和胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)受阻，从而导致血管壁脂质沉积和As的发生发展。已有研究表明miR-19b在人As斑块中高表达，而在正常动脉壁上无表达。这就提示miR-19b抑制ABCA1表达参与了As发生发展的过程。

本研究初步证实了miR-19b调控巨噬细胞ABCA1的表达，但是miR-19b对ABCA1的具体调控机制、体内验证miR-19b的调控作用及其对巨噬细胞脂质流出和As发生发展的影响有待进一步研究。总之，全面揭示miR-19b对ABCA1的调控作用及其机制，使其有望成为调控RCT及防治AS的新靶点。

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