烷氧染料木黄酮衍生物的合成及其抗癌活性研究

姚 旭，郑自通，郭 玉，余柳英，魏 云，郑 兴

(1.南华大学药学系，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院药剂科)

染料木黄酮(genistein，GEN)，主要存在于豆科植物中，是一种具有多种生物活性的大豆异黄酮，具有弱雌激素活性[1-2]、抗氧化活性和抗真菌活性[3-4]，对肝癌[5]、结肠癌[6]、肺癌[7]、胃癌[8]和前列腺癌[9]等多种疾病有积极的预防和治疗作用。但因染料木黄酮在肠道内吸收甚少或者完全不吸收致使其活性较低而限制了它的临床应用[10]。为了提高染料木黄酮的生物利用度，达到增强其抗癌活性的目的，本文以体外培养的人急性粒细胞性白血病(HL-60)细胞、人结肠癌细胞(HT-29)和人胃癌(SGC-7901)细胞为研究对象，以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)为阳性对照，选用MTT法对合成的4个烷氧染料木黄酮衍生物进行体外抗癌活性筛选。

1 材料与方法

1.1 主要材料

所用试剂均为分析纯，柱层析用硅胶G购自青岛海洋化工厂，HL-60细胞、SGC-7901细胞、HT-29细胞均由中南大学肿瘤研究所提供。X-5显微熔点测定仪，温度未校正；Bruker AM-300(300 MHz)型核磁共振仪，TMS作内标；Shimadzu IR-440型红外分光光度仪，溴化钾压片；HP-5989A型质谱仪；Italian Carlo-Erba 1106型元素分析仪；Bruker Apex Ⅱ质谱仪。

1.2 烷氧染料木黄酮衍生物的制备

染料木黄酮(100 mg，0.3 mmol)，用适量丙酮溶解，加入卤代烃RX(3 mmol)，K2CO3作催化剂，回流24 h，过滤，柱层析得到化合物2a、2b和3a、3b(见图1)。

图1 化合物2a、2b、3a、3b合成路线图

1.3 MTT法检测所合成染料木黄酮衍生物的抗癌活性

HL-60、HT-29、SGC-7901细胞培养于含10％热灭活小牛血清RPMI-1640培养基的培养瓶中，5％二氧化碳的培养箱内培养传代，实验取对数生长期细胞。实验在96孔细胞培养板中进行，以含细胞的加料RPMI-1640培养基接种于实验组、阳性对照组(5-Fu浓度为0.25 μmol/L)，溶媒对照组及调零组，每组设6个平行样本，每孔100 μL单细胞悬液(约2×104个细胞)。实验组每孔加入以培养基稀释的药物100 μL，溶媒对照组加入等量的含0.02％DMSO和0.01％ Tween-80的培养液，调零组加入无血清RPMI-1640培养基100 μL，置二氧化碳培养箱培养48 h。每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，混匀，继续培养4～6 h，1 000 r/min离心10 min后吸除上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，震荡10 min，使紫蓝色沉淀充分溶解，在(EX-800型)酶标仪下，用调零孔校正零点，以570 nm波长测定A值。以6孔A值均数计算相对抑制率(IR)：IR=(1-实验组A值/对照组A值)×100％，重复3批实验。半数抑制浓度(50％ concentration of inhibition，IC50)采用SPSS软件计算。

2 结 果

2.1 化合物的合成

本实验合成了4个染料木黄酮衍生物2a、2b、3a、3b。

化合物2a Yield 83.5％；m.p.138～139 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：298(M+，100.00)，271(34.39)，132(21.39)，299(19.86)，166(19.24)，283(12.00)，138(11.48)，89(10.61)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：3.381(3H，s，OCH3)，3.900(3H，s，OCH3)，6.407(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.422(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，7.003(2H，d，J=9.9Hz，H-3′and H-5′)，7.484(2H，d，J=9.9Hz，H-2′and H-6′)，7.893(1H，s，H-2)，12.890(1H，s，OH)。以上数据与文献[11]报道的基本一致，可以确定该化合物为5-羟基-4′,7-二甲氧基染料黄酮。

化合物2b Yield 77.5％；m.p.117～119.5 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：349(M+，100.00)，308(37.62)，350(M+，23.86)，275(17.25)，291(16.94)，41(14.77)，293(14.48)；IR υmax(cm-1，KBr)：1649(C=O)，2954(OH)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.556～5.087(4H，m，2×CH2O)，5.283～5.485(4H，m，2×CH2)，5.928～6.114(2H，m，2×CH)，6.372(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，6.982(1H，d，J=2.1Hz，H-6)，7.428(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，7.833(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.862(1H，s，H-2)，12.981(1H，s，OH)；13C NMR(CDCl3)：180.824(C=O，C-4)，164.461(C-7)，162.722(C-5)，158.816(C-4′)，157.877(C-9)，152.675(C-2)，133.077(allyl-4′，CH)，132.047(allyl-7，CH)，130.056(2C，C-2′and C-6′)，123.633(C-3)，123.076(C-1′)，118.507(allyl-4′，CH2)，117.797(allyl-7，CH2)，114.906(2C，C-3′and C-5′)，114.654(C-10)，98.772(C-6)，93.134(C-8)，69.120(allyl-4′，OCH2)，68.868(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.for C21H18O5：C，71.99，H，5.18；Found：C，71.86，H，5.16。

化合物3a Yield 10.1％；m.p.161～163 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：312(M+，100.00)，313(75.82)，266(29.62)，267(25.53)，132(22.94)，283(20.88)，281(19.92)，282(17.92)；1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)：3.759(3H，s，OCH3)，3.806(3H，s，OCH3)，3.857(3H，s，OCH3)，6.484(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.635(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，6.940(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.416(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，8.167(1H，s，H-2)。以上数据与文献[11]报道的基本一致，可以确定该化合物为4′,5,7-三甲氧基染料黄酮。

化合物3b Yield 11.6％；m.p.101～104 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：390(M+，100.00)，361(95.87)，293(88.82)，41(45.92)，321(44.10)，349(37.56)，252(37.22)，362(34.97)；IR υmax(cm-1，KBr)：1644(C=O)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.546～4.637(6H，m，3×CH2O)，5.262～5.688(6H，m，3×CH2)，6.002～6.110(3H，m，3×CH)，6.383(2H，d，J=2.1Hz，H-6)，6.425(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，6.939(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.440(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.719(1H，s，H-2)；13C NMR(CDCl3)：175.179(C=O，C-4)，162.546(C-7)，160.303(C-5)，159.762(C-4′)，158.419(C-9)，149.970(C-2)，133.237(allyl-5，CH)，132.108(2C，allyl-7，allyl-4′，CH)，130.361(2C，C-2′and C-6′)，126.028(C-3)，124.548(C-1′)，118.545(allyl-5，CH2)，118.003(allyl-4′，CH2)，117.614(allyl-7，CH2)，114.555(2C，C-3′and C-5′)，110.268(C-10)，97.803(C-6)，93.592(C-8)，69.837(allyl-5，OCH2)，69.158(allyl-4′，OCH2)，68.799(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.For C24H22O5：C，73.83，H，5.68；Found：C，73.87，H，5.72。

2.2 染料木黄酮衍生物体外抗癌活性

以5-Fu为阳性对照，MTT法检测原料药染料木黄酮1与合成的4个烷氧染料木黄酮衍生物2a、2b、3a、3b对HL-60、HT-29、SGC-7901细胞增殖抑制作用，结果见表1。其中化合物3a对HL-60、HT-29和 SGC-7901细胞增殖的抑制作用均强于5-Fu。

表1 黄酮类化合物对HT-29、SGC-7901和HL-60细胞增殖的影响

3 讨 论

本文将部分烷氧基团引入到染料木黄酮的结构中，并通过MTT法检测它们对HL-60、HT-29、SGC-7901细胞增殖抑制作用。初步药理活性研究表明：所合成的染料木黄酮衍生物对HL-60、HT-29、SGC-7901细胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中衍生物3b对HL-60的抑制作用最强，衍生物3a对HL-60、HT-29、SGC-7901抑制增殖作用均明显强于阳性对照药5-Fu，这为进一步获得高效、低毒的抗癌先导物提供有利的依据。

[1]Boué SM,Wiese TE,Nehls S,et al.Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens[J].J Agric Food Chem,2003,51 (8):2193-2199.

[2]汤凌,任国峰.染料木黄酮在性激素相关疾病研究中的进展[J].中国老年学杂志,2009,29 (11):1436-1438.

[3]井乐刚,路芳,张永忠.大豆异黄酮的抗氧化活性[J].食品与发酵工业,2004,30 (2):62-65.

[4]Benjamin SB,Bond JH.Transmission of infection by endoscopy[J].Ann Intern Med,1993,119 (5):440-441.

[5]Mansoor TA,Ramalho RM,Luo X,et al.Isoflavones as apoptosis inducers in human hepatoma HuH-7 cells[J].Phytother Res,2011,25 (12):1819-1824.

[6]龚军,王正文,朱明才,等.金雀异黄素和5-FU对人结肠癌细胞株(SW480)的相互作用的体外观察[J].中国现代医学杂志,2006,16 (6):873-876.

[7]田甜甜,李际盛,王亚伟,等.染料木黄酮在小细胞肺癌H446细胞中通过抑制FoxM1通路发挥抗肿瘤作用[J].山东大学学报：医学版,2013,51 (6):44-48.

[8]张俊文,王丕龙.染料木黄酮对胃癌细胞侵袭转移的抑制作用[J].营养学报,2006,28 (3):252-254.

[9]Travis RC,Spencer EA,Allen NE,et al.Plasma phytoestrogens and prostate cancer in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrion[J].Br J Cancer,2009,100 (11):1817-1819.

[10]周乐,赵晓莉,狄留庆,等.黄酮类化合物口服吸收与代谢特征及其规律分析[J].中草药,2013,44 (16):2313-2320.

[11]戴立言,王晓钟,陈英奇.异黄酮类化合物的合成新方法[J].有机化学,2008,28 (12):2126-2131.