Akt1在环氧合酶-2抑制剂抑制宫颈癌Hela细胞增殖中的作用

刘小叶，周建斌，李 婷，黄余良

(南华大学附属第二医院妇产科，湖南 衡阳 421001)

宫颈癌是较为常见的女性生殖系统恶性肿瘤，据WHO统计，全球80％的宫颈癌患者集中在发展中国家，国内每年新增病例约11万以上[1]，对宫颈癌发病机制的研究越来越引起研究者的重视。环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素生物合成过程中重要的限速酶，COX-2是其中的一种亚型，生长因子，促炎症细胞因子等的激活可以促进COX-2的表达。大量的研究发现，COX-2存在于许多恶性肿瘤中，如结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和宫颈癌等，可能通过影响肿瘤细胞的增殖，增强肿瘤侵袭力，促进肿瘤转移等机制与恶性肿瘤的不良预后及低生存率密切相关[2-3]。氮-2，环己氧-4，硝基苯-甲基磺胺(NS398)是COX2的特异性抑制剂，研究发现它可抑制肿瘤的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，但其具体机制尚不清楚。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称为蛋白激酶B(protein kinase,PKB)。活化的Akt1可以抑制细胞的凋亡，促进细胞周期运行，促进细胞侵袭和转移[4]。本研究以人宫颈癌细胞株(Hela细胞)为研究对象，观察NS398对Hela细胞增殖的抑制作用及Akt1蛋白表达的变化，并采用Akt1激动剂活化Akt1，进一步探讨Akt1在NS398抑制Hela细胞增殖过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

NS398购自美国Sigma公司，溶解在100％二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，配成100 mmol/L的液体，实验时稀释至不同浓度。IGF-1购自澳大利亚GroPep公司，磷酸化Akt1单克隆抗体(即p-Akt，为Ser473位点磷酸化)购自美国Cell Signaling Technology公司，Western blotting免疫印迹所用二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。DMEM培养基购自美国Hyclone公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Hyclone公司，噻唑蓝(MTT)比色法试剂盒、丽春红染色剂及其它检测试剂盒均为国产试剂。

1.2 细胞株及培养条件

人宫颈癌细胞株(Hela细胞)购自中科院上海细胞生物学研究所。细胞贴壁生长于含双抗(青霉素和链霉素)及10％小牛血清的DMEM中，置37 ℃、5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，以0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1∶1(V/V)混合的消化液进行传代换液，各组实验分别取对数生长期的细胞进行。

细胞在给NS398和IGF-1前无血清培养基饥饿过夜，使细胞处于相同增殖状态。NS398用DMSO配制成50mmol/L的贮存液(使用时培养液中DMSO浓度不超过0.1％)，-80°C保存，使用时用无血清培养基稀释成所需要的工作浓度。

1.3 MTT比色法检测细胞的生长

取对数生长期的培养细胞，传代并接种于96孔板中，培养24 h后，以无血清培养液处理24 h，然后换含不同处理因素的培养液分别分组处理细胞，每组设5个复孔，分别培养相应的时间后，加入新鲜配制的MTT，再继续培养4h后，弃去培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)，10 min后在全自动酶标仪上测定570 nm处吸光度(A值)，以A570 nm值代表细胞活力。细胞生长抑制率(IR)按如下公式计算：生长抑制率(％)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。

1.4 Western blotting免疫印迹检测蛋白质的表达

采用悬浮缓冲液裂解细胞，常规提取细胞总蛋白。经BCA法蛋白定量后，各组分别取。50 μg蛋白进行电泳，转PVDF膜后用丽春红染色检测转膜效果，再用10％脱脂奶粉封闭PVDF膜，然后依次孵育一抗(4 ℃孵育过夜)、TBST液洗涤(三次，共15 min)、二抗(室温孵育1 h)，经TBST液洗涤(三次，共15 min)后，以Western免疫荧光检测试剂盒激发荧光，于暗室中显示于X光片，结果用凝胶图像分析系统对胶片扫描进行相对灰度分析。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 环氧合酶抑制剂NS398对Hela细胞增殖的影响

为了解NS398对Hela细胞增殖的影响，采用MTT法检测细胞的吸光度，计算IR值后显示，不同浓度(0、50、100、150、200 μmol/L)NS398分别处理细胞0，12，24，36，48 h后，细胞代谢MTT的能力明显降低，IR值逐渐上升，这表明NS398可明显抑制Hela细胞的生长，并且其抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)(图1)。

图1 MTT法分析不同浓度的NS398对Hela细胞生长抑制率的影响

2.2 环氧合酶抑制剂NS398对Hela细胞p-Akt1蛋白表达的影响

为观察环氧合酶抑制剂NS398对Hela细胞p-Akt1蛋白质表达的影响，采用不同浓度(0、50、100、150、200 μmol/L)NS398处理Hela细胞24 h后，以Western blotting免疫印迹法检测p-Akt1蛋白质的表达，结果显示，随着NS398浓度的增加，细胞中p-Akt1蛋白的表达逐渐下调，其效应呈浓度依赖性(P<0.05)(图2)。

图2 不同浓度NS398处理Hela细胞24h后p-Akt1蛋白质表达的变化

此外，为观察环氧合酶抑制剂NS398对Hela细胞p-Akt1蛋白质表达的影响的时效性，采用150 μmol/L的NS398处理Hela细胞不同时间(0，12，24，36，48 h)，以Western blotting免疫印迹法检测p-Akt1蛋白质的表达，结果显示，随着NS398处理时间的增加，细胞中p-Akt1蛋白的表达逐渐下调，其效应呈时间依赖性(P<0.05)(图3)。

图3 NS398(150 μmol/L)处理Hela细胞不同时间后p-Akt1蛋白表达的变化

2.3 Akt1激动剂IGF-1在NS398抑制Hela细胞增殖过程中的作用

为进一步探讨Akt1在环氧合酶抑制剂NS398影响Hela细胞增殖过程中的作用，在150 μmol/L NS398处理细胞的基础上，同时结合不同浓度的Akt1激动剂IGF-1(50，100，150 ng/ml)处理Hela细胞0，12，24，36，48 h，经MMT法检测细胞的吸光度并计算IR值后显示，Akt1激动剂处理后，Hela细胞代谢MTT的能力明显增强，其IR值逐渐下降，这表明Akt1活性增强可以在一定程度上逆转NS398对Hela细胞增殖的抑制作用，并且其作用呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)(图4)。

图4 不同浓度IGF-1对NS398(150 μmol/L)作用下的Hela细胞生长抑制率的影响

3 讨 论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率居女性生殖道肿瘤的首位，近年来其发病率有逐年上升和发病年轻化的趋势[5]，但目前宫颈癌的发病机制尚未完全阐述清楚。NS398是环氧合酶-2(Cycolooxygenase 2,COX-2)的选择性抑制剂，属磺胺类制剂的衍生物，是非甾体类抗炎药物之一[6]。近年来，大量的研究表明NS398除特异性地抑制COX-2的表达之外，还可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[7-8]。有研究发现，NS398可呈浓度依赖性抑制舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中MMP2的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[9]。邹明英等[5]研究发现，NS398抑制宫颈癌Hela细胞增殖及MMP2的表达。这些研究说明NS398可以抑制宫颈癌的发展，但其具体分子机制尚未研究清楚。我们在实验中也发现，NS398可呈浓度依赖性和时间依赖性抑制Hela细胞的增殖。

Akt1在组织中分布广泛，是Akt的亚型之一，也是PI3K/Akt通路下游的主要作用靶点。它作为细胞信号网络中的中枢环节，对细胞增殖、分化及存活等多种生物学业过程起重要的调节作用，参与调节肿瘤、糖尿病、炎症和动脉粥样硬化等疾病的发生。研究发现，Akt可磷酸化Caspase-9前体，抑制细胞凋亡[10]；上调抑癌基因c-Myc的表达，调节细胞周期，促进细胞的增殖[11]；Akt稳定转染的细胞株能诱导上皮间质转换且E-钙黏素表达下调，细胞黏附性降低，促进细胞的侵袭和转移，从而在肿瘤的发生发展中起着重要的作用[12]。此外，国内研究也发现，磷酸化Akt(p-Akt)特异性过表达于子宫内膜样癌中，与其侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关[13]。

本研究采用环氧合酶抑制剂NS398处理宫颈癌Hela细胞后，发现p-Akt1蛋白质表达下调，并且NS398的作用效应呈浓度依赖性和时间依赖性，这提示NS398抑制宫颈癌细胞增殖的作用可能与p-Akt1表达的下调有关。为明确Akt1在其中的作用，我们采用了不同浓度的Akt1激动剂IGF-1与NS398共同处理Hela细胞，结果发现，Akt1激动剂可以在一定程度上逆转NS398对Hela细胞增殖的抑制作用，并且其作用效应也呈浓度依赖性和时间依赖性。本实验表明，Akt1参与了NS398抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用，NS398可能是通过抑制Akt1的表达而影响Hela细胞的增殖。

总之，本研究证实了p-Akt1表达的变化能影响NS398对Hela细胞增殖的抑制作用，表明Akt1与宫颈癌的发生发展有着较为密切的关系，可能是环氧合酶-2抑制剂抗宫颈癌的可能作用机制之一。

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