蕨菜乙醇提取物的Ames试验研究

陈乃富，谷仿丽，陈乃东，戴 军

蕨菜是采自蕨科蕨属中蕨(Pteridium aquilinum L.)的幼嫩叶，已有研究表明蕨菜乙醇提取物中黄酮类化合物含量较高，可达干蕨菜粉的7.28%［1］，且具有抗氧化、调节血脂等作用［1－4］。但目前关于该提取物的致突变研究未见报道。为此，我们用改良的Ames试验对蕨菜乙醇提取物的致突变进行研究，以判断其是否具有致突变作用，为蕨菜的开发利用提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 旋转式蒸发器、TU1201分光光度计、高速冷冻离心机、液氮罐、高压灭菌锅、振荡培养箱、恒温培养箱、电子天平、微量注射器、常用接种工具、培养皿及常用玻璃仪器。

1.1.2 试剂 牛肉膏、混合蛋白胨、D－生物素、L－组氨酸、氨苄青霉素、结晶紫、四环素、二甲基亚砜(DMSO)、辅酶 －Ⅱ、葡萄糖 －6－磷酸钠盐、玉米油、敌克松(Dexon)、2－乙酰氨基芴(2－AF)及相关常用试剂等。

1.1.3 受试物 蕨菜乙醇提取物，本实验室自制，冰箱冷藏。

1.1.4 菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由安徽医科大学毒理学实验室提供。因突变型菌的某些特性易丢失或变异，因此，在使用前按照文献［5］中方法进行鉴定，4种菌株鉴定结果均合格。

1.2 实验方法

1.2.1 受试物的制备和组氨酸含量测定 ①受试物的制备:蕨菜干粉经乙醚脱脂后，用70%乙醇、80℃、料液比1:15提取两次，合并滤液，回收乙醇，得深褐色浆状物。②受试物中组氨酸含量测定:本实验所用菌株为组氨酸缺陷型，要求根据受试物系中是否含组氨酸来确定是否设定组氨酸对照组。按照文献［6］方法测得受试物中不含组氨酸量，因此，本实验无需设组氨酸对照组。

1.2.2 活化系统(S9和 S9混合液)的制备［7－8］①大鼠肝S9的诱导和制备:健康雄性SD大鼠，体重150 g左右，鼠龄约5～6周。将β－萘黄酮、注射用苯巴比妥钠溶于玉米油中，浓度为200 mg·mL－1，按500 mg·kg－11次腹腔注射，5天后断头处死动物，取出肝脏，滤纸吸干表面液体，称重后，用新鲜冰冷的0.15 mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，每1 g肝(湿重)加0.1 mol/L氯化钾溶液3 mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，组织匀浆器(20 000 r/min，1 min)中制成肝匀浆。以上操作均在无菌和局部低温环境中进行。将制成的肝匀浆在低温(0～4℃)高速离心机上以12 000 r/min离心10 min，吸出上清液为S9组分，分装后液氮保存。②S9肝液中的蛋白含量测定:根据Lowry法测S9肝液中的蛋白含量。将①制备中S9肝液稀释100倍后测定其蛋白质含量为0.111 mg/mL，符合实验要求［5］。③10%S9混合液由S9液和辅助因子(S9混合液试剂)组成。

1.2.3 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)(平板渗入法)［5］①分组:实验分为加S9与不加S92大类。每个类别中又将受试物分为5个剂量组，设阴性对照(自发回变)、溶剂对照以及阳性对照3个对照组，每个组别设3个平行皿进行同步实验。阴性对照(自发回变)组只在培养基上加菌液，溶剂对照组为添加二甲基亚砜(DMSO)，不加S9的阳性对照物为敌克松(Dexon)，加S9的阳性对照物为2－乙酰氨基芴(2－AF)。5个剂量组分别为每皿50、100、200、400、800 μg受试物。具体操作为将受试物溶于顶层培养基中，放入45℃恒温水浴保温，再依次加入测试菌株新鲜菌液0.1 mL、S9混合液0.25 mL，混匀，迅速倾入底层培养基上，使之均匀分布在底层培养基上，平放固化。②培养条件和数据统计:接种固化后的平皿置于37℃下的恒温箱培养48 h，计每皿菌落数。整个试验重复2次。

1.3 统计学方法

2 结果与分析

两次试验结果统计如下，见表1，随着受试物剂量的增加，突变菌落数随之增加，但受试物各剂量组的回变菌落数均未超过阴性对照(自发回变)菌落数的2倍，且无剂量－反应关系，说明不论加与不加S9，受试物对鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株均未呈现致突变性［9］。而阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍以上，证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效。本实验结果说明蕨菜乙醇提取物无致突变作用。

表1 蕨菜乙醇提取物的Ames试验菌株的回变结果(X±S)

3 讨论

Ames试验是由Ames在1975年建立的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是一种已被公认并广泛采纳的致突变鉴定方法［8］。蕨采乙醇提取物中的主要有效成分为黄酮类化合物，对细胞氧化系统有一定的保护作用［1，3－4］，提示其有一定的开发价值，但无论是保健品还是药品开发，其安全性评价是非常重要的。本实验研究表明蕨菜乙醇提取物在一定的剂量范围内不具有致突变作用，有着进一步深入研究和开发的价值。

［1］ 陈乃富.蕨菜黄酮类化合物的提取及其抗氧化作用［J］.食品与发酵工业，2003，29(11):63 －66.

［2］ 陈乃富，张莉.蕨菜黄酮类化合物的提取与分析［J］.中国林副特产，2004(6):1－4.

［3］ 陈乃富，黄新华，季洪武.蕨菜黄酮对小鼠体内丙二醛含量的影响［J］.生物学杂志，2006，23(4):30 －33.

［4］ 陈乃富，季洪武，黄新华.蕨菜黄酮对环境胁迫因子(铅)引起的小鼠细胞氧化的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2007，13(2):120－123.

［5］ 杜文欣.现代保健食品研发与和生产新技术新工艺及注册申报实用手册:第4卷［M］.北京:中国科技文化出版社，2005:1514－1524.

［6］ 潘军华.比色法快速测定发酵液中组氨酸［J］.无锡轻工大学学报，2002，21(3):254 －259

［7］ 王亚其，李宏霞，肖凯，等.两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中的比较［J］.现代预防医学，2006，33(4):457－463.

［8］ 李奇慧，朱明学，张黎明，等.硫芥诱导小鼠染色体畸变和微核形成作用研究［J］.第三军医大学报，2004，26(19):1701－1703.

［9］ 马茂才，黄萍，晏辉，等.纳米二氧化钛和纳米锌的Ames试验［J］.癌变·畸变·突变，2010，22(4):302－304.