草果多糖的含量测定

卢小雪，张德威，黄雨晴，和小娟，黄锁义*

多糖是由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的天然大分子物质。研究表明，多糖及其复合物分子具有重要的生理作用［1］。

草果(Amomum tsao-ko)为姜科豆蔻属(Amomum Roxb.)植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的成熟果实，又名草果仁、草果子、老寇，味辛、性温，入脾、胃二经，能温中、行气、燥湿为药食两用同源植物［2］。中国药典(2010年版)记载草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)为两用同源植物［2］。中国药典(2010年版)记载草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)为姜科豆蔻属植物草果的干燥成熟果实，主产于广西、云南、贵州等地，具有燥湿温中、截虐除痰的功效，用于寒湿内阻、痞满呕吐、疟疾寒热、瘟疫发热等证。在民间，草果主要用于疟疾、咽喉感染、腹痛、胃功能失调、消化不良、恶心呕吐和腹泻等［3］。

1.1 原料与试剂

无水乙醇AR;乙醚 AR;氯仿 AR;苯酚AR;硫酸AR;正丁醇AR;葡萄糖标准品(J＆K CHEMICAL LTD);贵港草果购自广西百色市药店。

1.2 主要仪器设备

台式连续投料粉碎机(温岭市林大机械有限公司);电热式恒温水浴锅(江苏金坛宏凯仪器厂);电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);722N可见分光光度计(上海精科科学仪器有限公司);循环水真空抽气泵(上海嘉鹏科技有限公司);DHG-9070A型电热恒温旋风干燥箱(上海精密设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 贵港草果多糖的提取

将贵港草果打磨成粉末精确称取9 g，分成3等份，加入100 mL的烧杯中，蒸馏水加至40 mL，将其置于65℃电热恒温水浴锅中，水浴3 h后，进行抽滤，将滤液放于大烧杯中，同样方法将草果多糖重复提取3次，再用电热恒温水浴锅将合并滤液加热浓缩至15 mL左右，冷却30 min后，加入乙醇60 mL，避光静置1 d，抽滤，用乙醇和乙醚依次将滤饼多次清洗至见棕黄色粉末状固体，称量得到0.095 g。

2.2 贵港草果多糖粗品的提纯

2.2.1 Sevage 法脱蛋白［4］

取上一步得到的粗多糖溶液放于烧杯中，加入相当于粗多糖溶液体积1/4氯仿-正丁醇(预先配制成体积比为4∶1混合液)，充分摇晃30 min后，然后用分液漏斗将水与氯仿分开。将水再再加入相当于其体积1/4的氯仿-正丁醇溶液，重复上述过程，共计重复3次。最后将的到液体用电热恒温旋风干燥箱烘干，及得样品多糖为w1，称量w1=0.028 g。

2.3 贵港草果多糖含量测定

2.3.1 标准溶液的配制和标准曲线的测定［5］

精确配制5.0%的苯酚溶液和0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。再依次精确配制 10、20、40、60、70μg/mL的不同浓度的葡萄糖对照品系列溶液。分别准确量取5份1.00 mL样品液，分别置于10 mL具塞比色管中，加苯酚溶液1.50 mL，浓硫酸溶液7.50 mL，混匀放置30 min，用可见分光光度计测其吸光度值(在λ=486 nm处)，绘制标准曲线，求得回归方程:A=0.065 4C-0.005 7，r=0.999 6。

2.3.2 贵港草果多糖提取测定(苯酚-硫酸［6-7］)

称取草果多糖0.01 g，量取1 mol/L H2SO42 mL依次置于10 mL试管中，在100℃水中加热2 h，冷却20 min后再移至100 mL容量瓶，并用蒸馏水定容。分别量取5份1.0 mL样品液，5份1.5 mL 5%苯酚溶液，5份7.5 mL浓硫酸溶液依次置于5个具塞比色管中，混匀后静置30 min，用可见分光光度计测其吸光度值(在λ=486 nm处)，计算贵港草果多糖的含量，测得结果如表1。

表1 紫外可见分光光度计平行测定贵港草果多糖溶液的吸光度

据标准葡萄糖线性回归方程，计算出平均浓度，结果为 C=3.102 4 μg/mL。

根据公式F=m/(C×D)计算草果多糖与葡萄糖之间的换算因子。由实验可知m为称取的粗多糖的质量0.010 0×106μg，D为粗多糖稀释液倍数100 0，代入公式计算得 F=3.223。

2.3.2.1 粗多糖提取率的计算［8］及回收率的测定

根据公式粗多糖提取率(%)=［C×D×F×K/m0×106］×100(%)计算粗多糖提取率。K=(贵港草果制备的样品多糖m1)/(0.010 g贵港草果多糖)，计算得 K=2.806;C=3.102 4 μg/mL;D 为粗多糖稀释液倍数100 0;F=3.223;m0为贵港草果干粉重量9 g。代入公式计算得:

粗多糖提取率(%)=0.312%。

取5支10 mL具比色管中，分别量取不同浓度的对照品溶液 1 mL，15.0%苯酚溶液 1.5 mL，浓硫酸溶液7.50 mL，充分混匀后静置20 min，再分别加入“2.3.3”中的粗多糖溶液 0.1 mL，用可见分光光度计测其吸光度值(在λ=486 nm处)，计算出回收率 =97.14%，RSD=0.827%(n=5)。

3 结论

3.1 贵港草果多糖的含量为0.312%，回收率为97.14%，RSD=0.827%(n=5)。

3.2 多糖是强极性分子，溶于水而不溶于有机溶剂的特点采用热水浸提法提取，以防止引起糖苷键的断裂。

3.3 多糖在人们的生产和生活中具有广泛的应用前景，本研究方法简便准确可行，并且为草果多糖的开发与利用提供了可靠的理论依据。

［1］ 方一苇.具有药理活性多糖的研究现状［J］.分析化学，1994，11(9):955-960.

［2］ 国家药典委员会，中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:165.

［3］ Yang Y，Yue Y，Runwei Y，et al.Cytotoxic，apoptotic and antioxdidant activity of the essential oil of Amomum tsao-ko［J］.Bioresour Technol，2010，101(11):4205

［4］ 刘成海，万菌，涂宗财，等.百合多糖脱蛋白方法的研究［J］.食品科技，2002，23(1):89-90.

［5］ 李金花，农石生，黄锁义，等.芒果叶多糖的提取及含量测定［J］.食品研究与开发，2012，33(3):135-137.

［6］ 赵云涛，国兴明，李付振.金樱子多糖的抗氧化作用［J］.云南中医中药杂志，2003，24(4):35-37.

［7］ 钟岩，潘浦群，王艳红，等.苯酚-硫酸法测定鲜人参中多糖含量［J］.时珍国医国药.2008，19(8):57-58.

［8］ 刘志成.艾叶中黄酮和多糖的提取及分析［D］.湖南师范大学硕士学位论文，2009.