HPLC法测定3种老鹳草药材中没食子酸和柯里拉京的含量

许 敏，陈 颖，段素敏，刘丽芳

老鹳草为我国传统中药，2010版药典规定其正品为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗(Erodium stephanianum Willd.)、老鹳草(Geranium wilfordii Maxim.)或野老鹳草(Geranium carolinianum L.)的干燥地上部分，前者习称“长嘴老鹳草”，后两者习称“短嘴老鹳草”［1］。其化学成分以鞣质、黄酮类最为丰富［2］，是其重要的药效成分。鞣质的药理活性已远不止于收敛固涩，而广泛应用于抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝病、止血及抗肿瘤等领域［3］。没食子酸和柯里拉京为老鹳草素的主要分解产物，采用HPLC法对它们进行含量测定，并比较了3种不同来源老鹳草药材中这2种成分含量的差异，为老鹳草药材质量标准的制定和进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200 HPLC Series液相色谱仪(Agilent公司，美国);(150 mm ×4.6 mm，5 μm)(Dikma公司，美国);BS124S万分之一分析天平(Sartorius);LD24型高速中药粉碎机 (浙江省温岭市大海药材器械厂);没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110831－200302);柯里拉京对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111623－200301);老鹳草(Geranium wilfordii Maxim.)(采于吉林省通化市东昌区玉皇山)，牻牛儿苗(Erodium stephanianum Willd.)(采于山东潍坊)，野老鹳草(Geranium carolinianum L.)(采于中国药科大学植物园);乙腈为色谱纯(Tedia公司，美国);水为乐百氏纯净水;其他试剂均为分析纯。

图1 样品的HPLC图

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱:Diamonsil C18(2)色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)(迪马公司，美国);流动相:乙腈 －0.1%磷酸溶液，梯度洗脱(洗脱程序见表1);柱温:25℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20μL;检测波长:274 nm;色谱图见图1。

表1 洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取样品粉末约0.5 g(过40目筛)，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加水25 mL，100℃水浴回流1.5 h，过滤，滤渣再用纯净水25 mL同法提取1次，合并滤液，转移至50 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL中含0.101 2 mg的溶液;精密称取柯里拉京对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL中含0.126 0 mg的溶液，即得。

2.3 标准曲线的绘制

2.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

精密吸取0.101 2 mg/mL的没食子酸对照品溶液，用50%甲醇配置成浓度为0.010 12 mg/mL、0.025 3 mg/mL、0.050 6 mg/mL、0.075 9 mg/mL、0.101 2 mg/mL的5种溶液，摇匀，分别进样20μL，用上述色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标，测得的峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程:Y=2 742.5X+29.546，r=0.999 6。表明在0.202 4μg ～2.024 0μg之间有良好的线性关系。

2.3.2 柯里拉京标准曲线的绘制

精密吸取0.126 0 mg/mL的柯里拉京对照品溶液，用50%甲醇配置成浓度为 0.006 3 mg/mL、0.012 6 mg/mL、0.025 2 mg/mL、0.063 0 mg/mL、0.126 0 mg/mL的5种溶液，摇匀，分别进样20μL，用上述色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标，测得的峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程:Y=1 845.4X － 58.619，r=0.999 2。表明在0.126 0μg ～2.520 0μg之间有良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取等体积的没食子酸(0.025 3 mg/mL)、柯里拉京(0.025 2 mg/mL)对照品溶液注入液相色谱仪，重复6次，没食子酸RSD=1.6%，柯里拉京RSD=4.3%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别于 0、3、6、9、12、24 h测定，没食子酸 RSD=4.8%，柯里拉京 RSD=2.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一样品6份，按“2.2.1”项方法制备，在“2.1”项条件下测定，没食子酸含量分别为0.23%、0.22%、0.23%、0.23%、0.23%、0.23%，平均值为0.23%，RSD=1.7%;柯里拉京含量分别为0.23%、0.23%、0.23%、0.23%、0.23%、0.21%，平均值为0.23%，RSD=3.4%，表明方法的重复性良好。

2.7 检测限及定量限

分别将没食子酸和柯里拉京对照品溶液逐渐稀释后进样，取S/N=3时的浓度为检测限，经测定，没食子酸检测限为0.032μg/mL，柯里拉京检测限为0.126μg/mL;取S/N=10时的浓度为定量限，经测定，没食子酸定量限为0.063μg/mL，柯里拉京定量限为0.252 μg/mL。

2.8 回收率试验

精密称取0.25 g样品6份，分别加入相当于样品含量100%的两种对照品，同样品测定方法提取、制备、计算，结果见表2，表明本法具有较好的准确性。

2.9 样品的含量测定

分别精密称取老鹳草、野老鹳草、牻牛儿苗粉末约0.5 g，按“2.2.1”项方法处理，分别精密吸取供试品溶液进样20μL，用外标法测定含量(n=3)，结果见表3。

表2 回收率测定结果

表3 含量测定结果

3 讨论

3.1 老鹳草素(geraniin)属于可水解鞣质中的鞣花鞣质(ellagitannin)，加水分解时分解为没食子酸，六羟基联苯二甲酸，柯里拉京，鞣花酸等［4］。有报道对野老鹳草采用水提［5－6］，实验发现水提均可增大3种老鹳草来源中没食子酸和柯里拉京的含量。

3.2 前期考察了不同提取溶剂:50%甲醇、50%丙酮、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇和水回流提取，结果证实水提取得到没食子酸、柯里拉京总量最多，又比较了不同提取时间(1 h、1.5 h、2 h)和提取次数(1次、2次、3次)，结果表明水回流1.5 h提取两次基本提取完全。

3.3 样品测定结果表明，3种来源的老鹳草中没食子酸和柯里拉京的含量差异较大:老鹳草中没食子酸和柯里拉京的含量最低，两者仅为0.2%左右;野老鹳草和牻牛儿苗中没食子酸的含量均较高，其中牻牛儿苗中最高;牻牛儿苗中柯里拉京的含量是老鹳草的15倍、野老鹳草的2倍。研究表明［7］，柯里拉京具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等广泛的生物活性，具有很大的药用价值，市场前景广阔，已引起国内外学者的重视，本研究结果对该化合物的进一步深入研究和开发提供了有益的参考。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:113.

［2］ 吴秋月，齐洁，李默影，等.牻牛儿苗的化学成分研究［J］.中医药学报，2012，40(1):76 －78.

［3］ 吴悦涛，金哲雄.老鹳草中鞣质类化学成分及其药理活性研究进展［J］.黑龙江医药，2008，21(1):67 －68.

［4］ 杜晓鸣，郭永泗.老鹳草素及抗氧化作用［J］.国外医药植物药分册，1990，5(2):57 －61.

［5］ 金欣，王锋，姚岚，等.HPLC测定野老鹳草中没食子酸和鞣花酸的总量［J］.中成药，2010，32(7):1172 －1176.

［6］ Wu Qiuyue，Zhou Yang，Jin Xin，et al.Chromatographic Fingerprint and the Simultaneous Determination of Five Bioactive Components of Geranium carolinianum L.Water Extract by High Performance Liquid Chromatography.［J］.Int J Mo Sci，2011，12，8740－8749.

［7］ 陈一燕，陈崇宏.柯里拉京药理活性研究进展［J］.中国现代应用药学，2010，27(5):390－394.