《美国药典》35版附录“＜62＞非无菌产品微生物检查:控制菌检查法”中两个问题的探讨*

刘洪祥，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

《美国药典》由美国药典委员会编辑出版［1］，是对药品质量标准和检定方法的技术规定［2］，也是药品生产、使用、管理、检验的法律依据［3，4］。随着中国加入WTO后，药品的原料及各种制剂的进、出口量逐年迅猛增加，在进口药品注册和进口药品质量复核的检验标准及方法中均需参照进、出口国的药典［5，6］。《美国药典》35版附录“＜62＞非无菌产品微生物检查:控制菌检查法”耐胆盐革兰阴性菌检查中包含定量试验和定性试验，均需经预培养使药品中污染的微生物复苏，且要求预培养对污染微生物只复苏但不增殖，否则直接影响进一步的定量试验结果;肠道增菌肉汤的选择性增菌情况对定量试验和定性试验两部分均有着重要的意义。因此，本文针对这两个问题做了初步的探索，以期为该方面的药检工作提供基础性的参考意见。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 大肠埃希菌 Escherichia coli［CMCC(B)44 102］，铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa［CMCC(B)10 104］，沙门菌 Salmonella group［CMCC(B)50 094］，阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii［ATCC(B)51 329］，天津市药品检验所抗生素室保藏菌种。

1.1.2 培养基 ① pH 7.0氯化钠 －蛋白胨缓冲液(北京三药科技开发公司，批号120327);②胰酪大豆胨肉汤(1号国外厂家、2号国内A厂家、3号国内B厂家、4号国内C厂家、5号为按标准处方自制);③肠道菌增菌肉汤(1号国外厂家、2号国内A厂家)。

1.1.3 主要设备仪器 30%外排生物安全柜 Heal Force HFsafe－1200(力康生物医疗科技控股有限公司);压力蒸汽灭菌器SANYO MLS－3780型 (日本三洋公司);隔水培养箱 GNP－9270型 (上海精宏试验设备有限公司);恒温培养箱Thermo SCIENTIFIC 146E(美国热电公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 按《美国药典》35版附录“＜62＞非无菌产品微生物检查:控制菌检查法”制得原菌悬液，用pH 7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液以10倍稀释法制得每1 ml菌数约≤100 cfu的悬液，涉及特殊菌数时将会在具体试验中标注。

1.2.2 菌落计数 取适量菌悬液，采用营养琼脂平皿倾注法试验。

1.2.3 供试液的制备 按《美国药典》35版附录“＜61＞非无菌产品微生物检查:微生物计数”，取10 g供试品至250 ml无菌三角瓶中，加胰酪大豆胨肉汤稀释至100 ml，制成1∶10供试液。

1.2.4 增殖率与复苏率 增殖率(%)=［(预培养后菌数－加入菌数)/加入菌数］×100%;复苏率(%)=(预培养后菌数/加入菌数)×100%。

1.2.5 肠道增菌肉汤的变色试验 取1 ml菌数约≤100 cfu的菌悬液，加入10 m l肠道增菌肉汤中，30℃静止培养18、40和70 h，观察变色反应并测定pH值。

2 结果与讨论

2.1 胰酪大豆胨肉汤的预培养情况考查 《美国药典》35版附录“＜62＞非无菌产品微生物检查:控制菌检查法”规定预培养方法为，取不少于1 g的供试品，用胰酪大豆胨肉汤作为稀释剂制成1∶10供试液，混匀，在20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复，但不增殖(一般2～5 h)。

2.1.1 无供试液预培养情况 取1号、2号、3号、4号和5号胰酪大豆胨肉汤培养基各9 ml，分别加入1 ml菌数约≤100 cfu的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌和沙门菌四种菌的菌悬液，于20℃和25℃静止培养2 h，见表1。

表1结果表明，经2 h预培养，5种胰酪大豆胨肉汤对各试验菌均有不同程度的增殖作用。高限培养温度25℃时，增殖率为34.0% ～233.3%;低限温度20℃时，增殖率为1.1% ～159.3%;25℃的增菌率明显高于20℃。在低限温度20℃时，培养最短时间2 h，5种不同来源培养基中最低增殖率为1.1%，而非不增殖。

表1 不同胰酪大豆胨肉汤对四种耐胆盐革兰阴性菌的预培养结果

2.1.2 含供试液情况下预培养情况 在供试液中人工污染大肠埃希菌，以模拟实际检验时受损污染菌的复苏与增殖情况。试验采用1号培养基，人工污染大肠埃希菌，于25℃静止培养5 h，每0.5 h计数1次。

取百日咳糖浆和止咳颗粒两种供试品试验，结果见表2。百日咳糖浆无抑菌作用，每100 ml的1∶10供试液中污染47 cfu时，在2 h开始增殖，每100 ml的1∶10供试液中污染320 cfu时，从0.5 h就发现增殖，至5 h增殖率分别为4368%和3119%;止咳颗粒有一定的抑菌作用，每100 ml的1∶10供试液中污染47 cfu时，预培养4.5 h未见增殖，5 h时增殖至100 cfu，增殖率为113%;污染320 cfu时，3.5 h菌落计数结果为100 cfu，复苏率31%，至5 h增殖率为88%。上述结果表明，在胰酪大豆胨肉汤中人工污染微生物经2～5 h预培养，不能完全保证充分恢复但不增殖，在有一定抑菌作用的止咳颗粒样品存在的情况下，5 h増殖率能达到88%，影响定量测定结果。

表2 胰蛋白胨大豆肉汤对样品预培养情况____

2.2 肠道菌增菌肉汤的变色指示能力探讨 取相当于1 g供试品量的预培养物接种至肠道菌增菌肉汤，增菌后划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，进行定性试验。取相当于0.1、0.01和0.001 g供试品量的预培养物或预培养物稀释液接种至肠道菌增菌肉汤，增菌后划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，通过最可能数法得出定量试验结果。

肠道菌增菌肉汤增菌液，以及该培养基适用性检查中促生长能力试验结果中，均发现了不同来源培养基显示不同颜色，《美国药典》35版附录仅提及促生长能力，并未提及颜色指示能力，因此本试验进行了相关研究。

2.2.1 不同培养基的变色情况 本试验采用大肠埃希菌进行，图1为1号培养基在18、40和70 h的颜色变化情况，由绿色逐渐变为黄。图2为2号培养基在18、40和70 h的颜色变化情况，颜色由蓝绿色变为浅绿色。肠道菌增菌肉汤培养基的配方中，含有亮绿成分，其作为选择性抑制剂，抑制革兰阳性菌生长，而使肠杆菌科及其他革兰阴性菌呈优势生长，亮绿颜色变化范围为pH 0.0(黄)～2.6(绿)，具有弱变色指示能力。表3中1号和2号两种培养基pH测定结果，不在亮绿颜色变化范围pH 0.0(黄)～2.6(绿)，符合溴麝香草酚蓝的变色范围 pH 6.0(黄)～7.6(蓝)，1号培养基(进口)的明显颜色变化有可能是在标准处方中添加了溴麝香草酚蓝。

表3 肠道增菌肉汤中大肠埃希菌(61 cfu)增殖后的pH变化情况

图1 1号培养基颜色变化情况

图2 2号培养基颜色变化情况

2.2.2 不同培养基的未变色情况 为了进一步分析肠道增菌肉汤变色或未变色可能的原因，分别接种铜绿假单胞菌至1号和2号培养基中观察pH值和颜色变化。图3和图4分别为1号和2号两种培养基在18、40和70 h的颜色情况，培养前后培养基颜色均未变色。1号和2号两种培养基pH测定结果，见表4，铜绿假单胞菌在该培养基培养的生长过程中未引起pH值的变化。

表4 肠道增菌肉汤中铜绿假单胞菌(30 cfu)增殖后的pH变化情况

图3 1号培养基的颜色变化情况

图4 2号培养基的颜色变化情况

3 结论

通过对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌和沙门菌在不同厂家生产的胰酪大豆胨肉汤中预培养情况的分析，发现《美国药典》35版附录“＜62＞非无菌产品微生物检查:控制菌检查法”中“耐胆盐革兰阴性菌”项下的“供试液制备和预培养”中提及“培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖(一般2～5 h)”，在实际检验工作中无法准确控制，菌体基本都会出现增殖的现象，这会对定量试验结果造成一定的影响。因此，建议根据实际情况，采用不同的胰酪大豆胨肉汤预培养条件，尽量减少菌体增殖、降低试验的偏差。此外，对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌在不同厂家的肠道菌增菌肉汤中增菌所引起的变色研究结果表明，耐胆盐革兰阴性菌包含细菌种类繁多、产酸能力有差异、不同菌株颜色变化不一致，该培养基颜色指示特性显然不是专属性指标，无论颜色变化与否都需进行下一步紫红胆盐葡萄糖琼脂平板划线试验确认。同《美国药典》35版附录所述一致，《美国药典》附录中未提及该培养基颜色指示能力。

1 陆玲宝，许明哲.《美国药典》的历史沿革和现状［J］.中国药事，2007，21(5):360

2 李芳.《美国药典》第24版“凡例”主要内容介绍［J］.中国药事，2000，35(11):782

3 郭忠平.2011年美国药典会科学与标准研讨会述评［J］.中国药品标准，2012，13(1):45

4 胡春丽，张珂良，汪丽.从中美两国药品质量标准现状看我国药品标准管理存在的问题［J］.中国药事，2012，16(4):328

5 李秋菲，闵红，宋愿智，等.《美国药典》(USP31/NF26)附录非无菌产品的微生物计数检查［J］.中国药品标准，2012，13(2):120

6 李文东，王国兰，余立.《美国药典》(USP28/NF23)附录无菌检查［J］.中国药品标准，2006，7(6):70