大鼠血浆中棉酚的检测*

栾 姝，姚 军，林晓密

(1.辽东学院医学院，丹东 118003;2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054)

棉酚又称棉籽醇，集中在棉籽仁的球状色腺体中，是一种姜黄色无气味的多酚色素，长久以来被用作男性避孕药，但该物质具有一定的毒性，长期用药能引起低血钾症和男性不可逆性不孕［1－4］，此外，大量棉酚进入消化道后，可刺激胃肠黏膜，引起胃肠炎;吸收进入血液后，能损害心、肝、肾等器官，表现为恶心、呕吐、胃部烧灼感，甚至出现胃肠出血等临床症状。

目前关于棉酚测定的方法多集中于棉籽油、棉籽饲料以及植物性食品等方面［5－12］，生物样品中棉酚含量测定的相关报道不多［13－15］，并且报道中生物样品的前处理方法比较复杂。为了考查棉酚在生物体内的蓄积及毒性情况，本实验以大鼠为研究对象，采用简单易行的溶剂提取法进行样品前处理，建立了大鼠血浆中棉酚含量的高效液相测定方法，该方法的建立为生物体内棉酚的残留检测提供了可靠的依据。

1 实验仪器、试剂与动物

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(配置紫外检测器，美国安捷伦公司);TGL－168高速离心机(上海安亭科学仪器厂);SK－1型快速混匀器(金壇市医疗仪器厂)。

1.2 试剂 棉酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号1517－200001，规格:20 mg);丙酮(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(色谱纯，Fisher Chemicals公司);磷酸(优级纯，北京红星化工厂)。

1.3 动物 雄性Wistar大鼠14只，体重120 g左右，由新疆医科大学动物中心提供，7只给药，7只留作空白，单笼饲养，每只给饲料15 g/d。给药组大鼠的饲料是由中棉所49棉籽仁粉(游离棉酚含量1.2%)与空白饲料以1∶2混合压制而成。

2 实验方法与结果

2.1 血样的采集 大鼠饲养第90 d时，内眼眦静脉丛取血，接于肝素抗凝管中，离心10 min(4℃，3000 r/min)，吸取血浆于 EP管中，－20℃冰箱中储存备用。

2.2 色谱条件 色谱柱为ODS－C18(4.6 mm×200 mm，5μm)，柱温25℃，流动相为甲醇－1%磷酸溶液(85∶15)，流速 1.0 ml/min，检测波长235 nm。

2.3 棉酚对照品溶液的制备 精密称取0.004 72 g棉酚对照品，用丙酮溶解，转移至50 ml棕色量瓶中，丙酮稀释定容，得到浓度为94.40μg/ml的棉酚对照储备液。分别取棉酚对照储备液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和 10.0 ml配制成浓度为 4.72、9.44、18.88、28.32、37.76 和47.20 μg/ml的棉酚对照溶液。

2.4 样品的处理 血浆样品于20℃快速融冻后，取500 μl于 EP 管中，加入1.5 ml的丙酮，涡旋5 min，以15 000 r/min离心8 min，离心后液体转移到另一个EP管中，氮气吹干，残余物用500μl丙酮定容，涡旋2 min，以15 000 r/min 离心 4 min，过 0.45 μm 微孔滤膜，进样20 μl。

2.5 标准曲线的制备 取6份500μl的空白血浆，分别加入棉酚对照品溶液35μl，配制相当于血中棉酚浓度分别为 0.33、0.66、1.32、1.98、2.64 和 3.30 μg/m l的质量控制(QC)样品，涡旋 30 s，加入丙酮 1.5 ml，涡旋5 min，以 15 000 r/min 离心 8 min，离心后液体转移到另一个EP管中，氮气吹干，残余物用500μl丙酮定容，涡旋2 min，以15 000 r/min离心4 min，过0.45μm微孔滤膜，进样20μl。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，回归方程:Y=80.634 X－2.5965(r=0.999 4，n=6)，线性范围 0.33 ～ 3.30 μg/ml，检测限为 0.04 μg/ml，S/N=3。

2.6 色谱专属性 血浆处理按照“2.4”项下操作，在“2.2”项色谱条件下测得大鼠空白血浆、棉酚对照品、空白血浆+棉酚对照品以及给药组大鼠血浆的HPLC色谱图。棉酚保留时间为14.8 min，空白血浆无干扰，见图1。

2.7 加样回收率与精密度 按照“2.5”项下方法配制浓度为0.33、1.32 和 3.30 μg/ml的样品，每个浓度各5份，在“2.2”项色谱条件下测定，记录棉酚的峰面积，测定日内及3 d内的日间精密度。结果，高、中、低三个浓度的平均加样回收率为96.1%，日内精密度为6.0%，日间精密度为7.7%，见表1。

2.8 提取回收率 按照“2.5”项下方法配制浓度为0.33、1.32 和3.30 μg/ml的样品，每个浓度各5 份，在“2.2”项色谱条件下测定，记录棉酚峰面积AT。取3份500μl空白血浆于EP管中，加入1.5 m l丙酮，涡旋5 min，以15 000 r/min离心8 min，离心后液体转移到另一个EP管中，分别加入35μl相应的棉酚对照品溶液，氮气吹干，残余物用500μl丙酮定容，涡旋2 min，以 15 000 r/min，离心4 min，过 0.45 μm 微孔滤膜，在“2.2”项下色谱条件下测定，记录棉酚峰面积均值AS。通过公式:R%=AT/AS可求出提取回收率。结果，大鼠血浆中游离棉酚的平均提取回收率为84.2%。

图1 空白血浆(A)对照品(B)空白血浆+对照品(C)给药组大鼠血浆(D)HPLC色谱图

2.9 稳定性 取给药组大鼠4号和5号血浆，按照“2.4”项下样品处理方法操作。4号于4℃冰箱中避光放置，5号于室温避光放置。分别在0、2、4、6、8和10 h依法测定，记录峰面积。结果，RSD分别为5.0%和9.8%。表明样品在4℃条件下储存，10 h之内比较稳定。

表1 回收率试验结果(n=5)

2.10 血浆样品的测定 取7只给药组大鼠的血浆，按照“2.4”项下方法进行样品处理。结果给药组大鼠血浆中均有游离棉酚存在，含量为0.68～2.14μg/ml。见表2。

表2 大鼠血浆中棉酚的含量检测

3 讨论

3.1 提取方法的选择 本实验考查了固相萃取法和丙酮提取法。结果，固相萃取法得到的质控样品在棉酚保留时间处没有出峰，可能是因为棉酚具有一定的吸附性，不易洗脱，也可能是因为棉酚的性质不稳定，在较长的前处理时间及温度较高的环境下发生氧化;丙酮提取法出峰情况良好，并且提取率高，省时、简便、可行。

3.2 提取溶剂的选择 本实验对乙腈、丙酮两种溶剂进行考查，结果大鼠血浆中游离棉酚的提取回收率分别为65.5%和83.2%，并且经丙酮处理的血浆，去蛋白效果更好，无干扰，因此采用丙酮作为提取溶剂。

3.3 色谱条件的选择 本实验所采用的色谱条件参照了相关实验方法［16］，该色谱条件对动植物中游离棉酚的检测均适用。

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5 植物性食品中游离棉酚的测定［S］.2003

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11 阎轶洁，宋维平，张建云.棉籽饼粕在畜禽中的应用及棉酚的脱毒方法研究［J］.饲料工业，2005，26(3):47

12 马勇健，石根勇，陈蓓.高效液相色谱法测定棉籽油中的游离棉酚［J］.卫生研究，1993，22(5):302

13 卞晓洁，丁黎，勉强辉，等.复方醋酸棉酚片在女性健康志愿者体内的生物等效性研究［J］.中国新药杂志，2007，15(16):1221

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15 Lee K J，Dabrowski K.High－performance liquid chromatographic determination of gossypol and gossypolone enantiomers in fish tissues using simultaneous electrochemical and ultraviolet detectors［J］，Journal of Chromatography B，2002，779:313

16 栾姝，孟磊，孙莲.高效液相色谱法测定棉籽仁中棉酚的含量［J］.食品科学，2010，31(4):198