栾 姝,姚 军,林晓密
(1.辽东学院医学院,丹东 118003;2.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830054)
棉酚又称棉籽醇,集中在棉籽仁的球状色腺体中,是一种姜黄色无气味的多酚色素,长久以来被用作男性避孕药,但该物质具有一定的毒性,长期用药能引起低血钾症和男性不可逆性不孕[1-4],此外,大量棉酚进入消化道后,可刺激胃肠黏膜,引起胃肠炎;吸收进入血液后,能损害心、肝、肾等器官,表现为恶心、呕吐、胃部烧灼感,甚至出现胃肠出血等临床症状。
目前关于棉酚测定的方法多集中于棉籽油、棉籽饲料以及植物性食品等方面[5-12],生物样品中棉酚含量测定的相关报道不多[13-15],并且报道中生物样品的前处理方法比较复杂。为了考查棉酚在生物体内的蓄积及毒性情况,本实验以大鼠为研究对象,采用简单易行的溶剂提取法进行样品前处理,建立了大鼠血浆中棉酚含量的高效液相测定方法,该方法的建立为生物体内棉酚的残留检测提供了可靠的依据。
1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(配置紫外检测器,美国安捷伦公司);TGL-168高速离心机(上海安亭科学仪器厂);SK-1型快速混匀器(金壇市医疗仪器厂)。
1.2 试剂 棉酚对照品(中国药品生物制品检定所,批号1517-200001,规格:20 mg);丙酮(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(色谱纯,Fisher Chemicals公司);磷酸(优级纯,北京红星化工厂)。
1.3 动物 雄性Wistar大鼠14只,体重120 g左右,由新疆医科大学动物中心提供,7只给药,7只留作空白,单笼饲养,每只给饲料15 g/d。给药组大鼠的饲料是由中棉所49棉籽仁粉(游离棉酚含量1.2%)与空白饲料以1∶2混合压制而成。
2.1 血样的采集 大鼠饲养第90 d时,内眼眦静脉丛取血,接于肝素抗凝管中,离心10 min(4℃,3000 r/min),吸取血浆于 EP管中,-20℃冰箱中储存备用。
2.2 色谱条件 色谱柱为ODS-C18(4.6 mm×200 mm,5μm),柱温25℃,流动相为甲醇-1%磷酸溶液(85∶15),流速 1.0 ml/min,检测波长235 nm。
2.3 棉酚对照品溶液的制备 精密称取0.004 72 g棉酚对照品,用丙酮溶解,转移至50 ml棕色量瓶中,丙酮稀释定容,得到浓度为94.40μg/ml的棉酚对照储备液。分别取棉酚对照储备液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和 10.0 ml配制成浓度为 4.72、9.44、18.88、28.32、37.76 和47.20 μg/ml的棉酚对照溶液。
2.4 样品的处理 血浆样品于20℃快速融冻后,取500 μl于 EP 管中,加入1.5 ml的丙酮,涡旋5 min,以15 000 r/min离心8 min,离心后液体转移到另一个EP管中,氮气吹干,残余物用500μl丙酮定容,涡旋2 min,以15 000 r/min 离心 4 min,过 0.45 μm 微孔滤膜,进样20 μl。
2.5 标准曲线的制备 取6份500μl的空白血浆,分别加入棉酚对照品溶液35μl,配制相当于血中棉酚浓度分别为 0.33、0.66、1.32、1.98、2.64 和 3.30 μg/m l的质量控制(QC)样品,涡旋 30 s,加入丙酮 1.5 ml,涡旋5 min,以 15 000 r/min 离心 8 min,离心后液体转移到另一个EP管中,氮气吹干,残余物用500μl丙酮定容,涡旋2 min,以15 000 r/min离心4 min,过0.45μm微孔滤膜,进样20μl。以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标作图,回归方程:Y=80.634 X-2.5965(r=0.999 4,n=6),线性范围 0.33 ~ 3.30 μg/ml,检测限为 0.04 μg/ml,S/N=3。
2.6 色谱专属性 血浆处理按照“2.4”项下操作,在“2.2”项色谱条件下测得大鼠空白血浆、棉酚对照品、空白血浆+棉酚对照品以及给药组大鼠血浆的HPLC色谱图。棉酚保留时间为14.8 min,空白血浆无干扰,见图1。
2.7 加样回收率与精密度 按照“2.5”项下方法配制浓度为0.33、1.32 和 3.30 μg/ml的样品,每个浓度各5份,在“2.2”项色谱条件下测定,记录棉酚的峰面积,测定日内及3 d内的日间精密度。结果,高、中、低三个浓度的平均加样回收率为96.1%,日内精密度为6.0%,日间精密度为7.7%,见表1。
2.8 提取回收率 按照“2.5”项下方法配制浓度为0.33、1.32 和3.30 μg/ml的样品,每个浓度各5 份,在“2.2”项色谱条件下测定,记录棉酚峰面积AT。取3份500μl空白血浆于EP管中,加入1.5 m l丙酮,涡旋5 min,以15 000 r/min离心8 min,离心后液体转移到另一个EP管中,分别加入35μl相应的棉酚对照品溶液,氮气吹干,残余物用500μl丙酮定容,涡旋2 min,以 15 000 r/min,离心4 min,过 0.45 μm 微孔滤膜,在“2.2”项下色谱条件下测定,记录棉酚峰面积均值AS。通过公式:R%=AT/AS可求出提取回收率。结果,大鼠血浆中游离棉酚的平均提取回收率为84.2%。
图1 空白血浆(A)对照品(B)空白血浆+对照品(C)给药组大鼠血浆(D)HPLC色谱图
2.9 稳定性 取给药组大鼠4号和5号血浆,按照“2.4”项下样品处理方法操作。4号于4℃冰箱中避光放置,5号于室温避光放置。分别在0、2、4、6、8和10 h依法测定,记录峰面积。结果,RSD分别为5.0%和9.8%。表明样品在4℃条件下储存,10 h之内比较稳定。
表1 回收率试验结果(n=5)
2.10 血浆样品的测定 取7只给药组大鼠的血浆,按照“2.4”项下方法进行样品处理。结果给药组大鼠血浆中均有游离棉酚存在,含量为0.68~2.14μg/ml。见表2。
表2 大鼠血浆中棉酚的含量检测
3.1 提取方法的选择 本实验考查了固相萃取法和丙酮提取法。结果,固相萃取法得到的质控样品在棉酚保留时间处没有出峰,可能是因为棉酚具有一定的吸附性,不易洗脱,也可能是因为棉酚的性质不稳定,在较长的前处理时间及温度较高的环境下发生氧化;丙酮提取法出峰情况良好,并且提取率高,省时、简便、可行。
3.2 提取溶剂的选择 本实验对乙腈、丙酮两种溶剂进行考查,结果大鼠血浆中游离棉酚的提取回收率分别为65.5%和83.2%,并且经丙酮处理的血浆,去蛋白效果更好,无干扰,因此采用丙酮作为提取溶剂。
3.3 色谱条件的选择 本实验所采用的色谱条件参照了相关实验方法[16],该色谱条件对动植物中游离棉酚的检测均适用。
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