HPLC法同时测定小儿抗病毒颗粒中黄芩苷和橙皮苷的含量*

王 健，孙 瑜，陈双璐，林 宏

(1.天津市儿童医院，天津 300074;2.天津中医药大学，天津 300193)

小儿抗病毒颗粒是以本院老中医的经验处方为基础，经改良制备工艺后制成的医院制剂，由黄芩、金银花、陈皮、连翘、天花粉、石膏等中药组成，具有清热解表，止咳定喘之功效，临床用于治疗感冒发烧，有汗或无汗，鼻流清涕及病毒性肺炎。黄芩苷为黄芩的有效成分，橙皮苷为陈皮的有效成分［1］，测定两者的含量可有效控制该制剂的质量。本文建立了一种采用高效液相色谱同时测定黄芩苷和橙皮苷含量的方法。该方法简便、准确，可靠，适用于本制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－2010A高效液相色谱仪，紫外检测器，Lcsolution工作站(日本岛津公司);EQAS1000GVDE型双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，十万分之一天平(梅特勒－托利多公司)，RE－52A旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110715－200815)，橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110721－200613);乙腈(天津市康科德科技有限公司)、磷酸(天津市科密欧化学试剂开发中心)均为色谱纯;水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);其余试剂均为分析纯。小儿抗病毒颗粒(本院院内制剂，批号20110101、20110201、20110301);阴性对照品为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Shim－pack VP－ODSC18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－水－磷酸(21∶79∶0.1);流速:1.0 m l/min;柱温:40 ℃;检测波长:283 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷对照品 2.25 mg、橙皮苷 1.30 mg，置 50 ml量瓶中，加入稀乙醇(按照《中国药典》2010年版一部附录配制)30 m l，超声15 min使溶解，取出，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别制成含黄芩苷45μg/ml、橙皮苷26 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备 将样品置于研钵中，研细，取约1 g，置100 ml量瓶中，加入稀乙醇适量超声处理(功率300 W，频率45 kHz)60 min，取出，放置至室温，再加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取除黄芩、陈皮外的处方量药材，按制备工艺制备不含黄芩、陈皮的阴性样品，再按上述样品溶液制备方法，制成不含黄芩、陈皮的阴性溶液。

2.3 系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定。结果表明，样品溶液与对照品溶液出现保留时间相同的色谱峰，而阴性样品溶液在相同保留时间处无色谱峰出现，证明其他辅料成分对测定结果无干扰。见图1。橙皮苷与黄芩苷的保留时间分别为 8.720和16.778，分离度 R≥1.5，满足含量测定要求。

图1 橙皮苷对照品(A)黄芩苷对照品(B)样品(C)阴性样品(D)高效液相色谱图

2.4 线性关系考查 分别吸取黄芩苷对照品溶液(45 μg/ml)6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 和 16.0 μl，橙皮苷对照品溶液(26 μg/ml)10.0、12.0、14.0、16.0、18.0和20.0 μl依次注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以对照品的浓度为横坐标(X)，以测得的峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，得黄芩苷的回归方程为:Y=2 849 744.13 X－13 379(r=0.999 96)，橙皮苷的回归方程为:Y=1 296 514.8 X －663.9(r=0.999 97)，表明黄芩苷在0.270 ～0.720 mg/ml范围内、橙皮苷在0.260 ～0.520 mg/ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 分别取“2.2.1”项下对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，每次10 μl，测定峰面积，橙皮苷RSD为0.41%、黄芩苷RSD为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批号的样品(批号20110301)适量，按照“2.2.2”项下样品溶液制备操作，按照“2.1”项色谱条件分析，分别在 0、2、4、6、8 和10 h进样10μl，测定峰面积，橙皮苷RSD为0.77%、黄芩苷RSD为0.51%，表明10 h内测定结果稳定。

2.7 重复性试验 取同一批号的样品(批号20110301)6份，按照“2.2.2”项下样品溶液制备操作，按照“2.1”项下色谱条件分析，每次进样量为10μl，测定样品含量。结果:橙皮苷平均含量4.145 mg/g、RSD为 0.81%;黄芩苷平均含量 5.586 mg/g、RSD 为0.35%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 分别精密称取橙皮苷与黄芩苷对照品适量，加稀乙醇制成浓度分别为0.1051、0.1400 mg/ml的溶液;另取本品约 0.25 g，精密称定，置50 ml量瓶中，各6份，加入稀乙醇30 ml，再精密加入上述黄芩苷的稀乙醇溶液10 ml，超声处理30 min，放置至室温，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过。取续滤液，制得供加样回收试验用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析测定，计算回收率，结果平均回收率为:橙皮苷99.73%(RSD 为 1.52%)、黄芩苷 101.8%(RSD 为0.63%)。结果见表1和表2。

表1 橙皮苷加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取3批小儿抗病毒颗粒样品(批号为20110101、20110201、20110301)，按照“2.2.2”项样品溶液制备操作，按“2.1”项色谱条件分析测定，计算含量，结果见表3。

表2 黄芩苷加样回收率试验结果

表3 样品中橙皮苷与黄芩苷含量

3 讨论

3.1 流动相的选择 本实验参考大量文献［2－5］，试用了不同的流动相，分别使用了甲醇 －水 －磷酸(44∶56∶0.2)、乙腈 －水 － 磷酸(20∶80∶0.1)及乙腈－水－磷酸(22∶78∶0.1)作为流动相，其橙皮苷或黄芩苷的保留时间不是很恰当，理论塔板数较低，且所呈现的图像中橙皮苷峰前有小的杂质峰，分离度不好。后选用乙腈－水－磷酸(21∶79∶0.1)理论塔板数提高，橙皮苷峰与杂质峰基本分离，且橙皮苷与黄芩苷峰的Rf值≥1.5，符合《中国药典》的要求，保留时间适中，其他成分几乎无干扰。故选此比例为流动相。

3.2 检测波长的选择 黄芩苷与橙皮苷在《中国药典》测定方法中检测波长分别为280 nm及283 nm，由于样品中橙皮苷的含量较黄芩苷少，为了提高橙皮苷的检测灵敏度，故选用283 nm作为检测波长。

3.3 溶剂和提取方法的选择 试用稀乙醇、70%甲醇进行样品中橙皮苷与黄芩苷的提取，结果两种成分的保留时间与峰面积相差甚微，由于稀乙醇毒性低，故本实验选用稀乙醇;同时考查了不同提取方法如加热回流法与超声法、及超声时间(30、45、60和90 min)长短对含量的影响，结果表明加热回流、超声60 min所得样品含量无差异，由于超声方法的简便、易操作性，故选择超声法。从超声时间长短来看，时间为60 min提取的更完全，故时间选定为60 min。

1 中国药典［S］.一部.2010:176

2 田玉清，王刚，赵才德.高效液相色谱法测定胃康胶囊中橙皮苷的含量［J］.现代中药研究与实践，2010，24(3):63

3 刘平，王艳君.HPLC法测定开光复明片中黄芩苷的含量［J］.中国药房，2007，18(27):2131

4 余琰，焦海胜，马立新.HPLC同时测定清气化痰丸中橙皮苷和黄芩苷的含量［J］.中成药，2005，27(8)，894

5 谭生建，刘刚，姜韧.高效液相色谱法测定枳实导滞丸中橙皮苷和黄芩苷含量［J］.解放军药学学报，2006，22(5)，387