一株耐NMMO纤维素酶菌株的筛选及发酵优化

夏东琴，何玉财，谭春伟，龚 磊，龚 婷，严生虎，张 跃，王利群

（1常州大学制药与生命科学学院生物工程研究室，江苏 常州 213164；2吉化集团公司研究试验厂，吉林 吉林132021）

随着化石资源的逐渐枯竭，利用纤维素等可再生资源生产生物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。地球上的纤维素资源非常丰富，有效地利用纤维素资源对人类面临的能源危机有现实意义。然而，纤维素原料具有较高的结晶度，且分子内与分子间存在大量的氢键，因此难被纤维素酶糖化，为了使纤维素原料高效地糖化，必须使用合适的方法将其进行预处理[1]。许多方法用于纤维素的预处理[1-3]。目前，N-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）作为高效的预处理溶剂可有效地溶解纤维素原料，如微晶纤维素和甘蔗渣[4-7]。研究表明，NMMO能溶解纤维素是由于N—O键的高极性，可破坏纤维素的氢键网络并且与溶质形成新的氢键，进而可预处理纤维素原料。但由于在纤维素中N—O键的高极性，NMMO的存在可能抑制纤维素酶的活性[5]。因此，筛选耐NMMO的高活性纤维素酶具有重要的现实意义。

本实验在常规筛选方法的基础上，利用富集培养技术[8]在富集培养基中加入10 g/L NMMO施加环境压力，筛选得到一株耐NMMO的高酶活菌株，鉴定其为地霉菌Galactomycessp.，进一步对其产纤维素酶条件进行优化，并利用发酵优化后得到的发酵上清液进行糖化实验，表明Galactomycessp.纤维素酶具有良好的耐 NMMO性能及应用前景。

1 材料与方法

1.1 样品采集

土样：采集于常州武进农村秸秆、稻草堆放处的腐殖性土壤。

甘蔗渣组分（质量分数）：纤维素34.9%，半纤维素28.4%，木质素19.5%，其它组分17.2%。

富集培养基——羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：CMC-Na 20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH=5.0。

发酵培养基：甘蔗渣 5 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Tween-80 8 g/L，pH=5.5。

以上培养基均在121 ℃灭菌20 min后使用。

1.2 产纤维素酶菌株的筛选

将采集的土样稀释1000倍，涂布于加入10 g/L NMMO的CMC-Na固体培养基表面，在30 ℃恒温富集培养5天后，用1 g/L的刚果红染色液浸染10 min，再用1 mol/L的NaCl溶液脱色5 min，根据透明圈直径与菌落直径的比值大小选取活性菌落，并用牙签点植到加有NMMO的发酵培养基中进行产酶发酵试验，用DNS测定酶活，筛选耐NMMO的高活力产纤维素酶菌株。

1.3 纤维素酶活力的测定

1.3.1 粗酶液的制备

将筛选得到的菌株接入种子培养基培养3 天，以1%（体积比）的接种量转接到基础培养基中培养7 天，然后在4 ℃、8000 r/min离心10 min，收集发酵上清液为粗酶液。

1.3.2 内切型β-1,4-葡聚糖酶（CMCase）活力测定

在50 mL锥形瓶中加入2 mL酶液，称取0.04 g CMC-Na加入到锥形瓶中，再加入8 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 值为4.8，0.05 mol/L）配制成10 mL的反应体系。将锥形瓶放入到50 ℃和160 r/min的恒温摇床中反应1 h。取样400 μL，离心取上清液，进行产物分析。

1.3.3 滤纸酶活（FPA）活力测定

在50 mL锥形瓶中加入2 mL酶液，将1×6 cm的滤纸加入到锥形瓶中，再加入8 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值为4.8，0.05 mol/L）配制成10 mL的反应体系。反应条件和测定同上。

1.4 纤维素酶酶活

纤维素酶酶活定义：一个酶活单位（international unit，IU）定义为在上述条件下，1min水解纤维素产生l μmol还原糖（以葡萄糖为准）所需的酶量[8]。

1.5 分析方法

1.5.1 DNS法

DNS溶液中的3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物。在过量的氢氧化钠碱性溶液中，此化合物呈橘红色，在520 nm波长处有最大吸收，在一定浓度范围内，还原糖的量与光的吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。取100 μL反应液和1.5 mL的3,5-二硝基水杨酸于试管中，另外取蒸馏水代替反应液作对照。沸水浴5 min，然后加入5 mL蒸馏水，混匀，用紫外分光光度计[尤尼柯UV-2100，尤尼柯（上海）仪器有限公司]测OD520。

1.6 产酶条件的优化

分别考察培养基成份（碳源、氮源和表面活性剂）和培养条件（初始pH值、温度等）对酶活的影响，以纤维素酶酶活FPA和CMCase为检测指标。

1.7 发酵上清液糖化甘蔗渣

（1）加NMMO体系中的糖化进程 在50 mL小锥形瓶中加入1.7 g NMMO、300 μL蒸馏水和7 mL乙酸-乙酸钠缓冲液，再加入2 mL发酵液、1 g/L的甘蔗渣，于50 ℃、160 r/min摇床中反应。

（2）不加 NMMO体系中的糖化进程 在 50 mL小锥形瓶中加入8 mL乙酸-乙酸钠缓冲液，再加入2 mL发酵液、1 g/L的甘蔗渣，于50 ℃、160 r/min摇床中反应。

2 结果与讨论

2.1 产酶微生物的筛选

通过初筛和复筛，从480份土壤中筛选到活性较高的菌株9株，研究发现编号CCZU11-1的菌株具有最高的纤维素酶活性。经ITS rDNA鉴定[8]，该菌是地霉菌属Galactomycessp.，命名为Galactomycessp. CCZU11-1，已保藏于中国微生物保藏中心，编号为CGMCC 5561。

图1 CCZU11-1进化树

2.2 发酵优化

2.2.1 碳源、氮源的影响

培养基碳源组成明显影响纤维素酶酶活。采用250 mL的三角瓶，装液量为100 mL，各种碳源分别添加到无碳源培养基[KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH=5.0]中，其终浓度为5 g/L，不同碳源（葡萄糖、稻草、滤纸、甘蔗渣和CMC-Na等）对Galactomycessp.CCZU11-1菌株纤维素酶酶活的影响如图2所示。由图2可知，以葡萄糖、CMC-Na、滤纸和稻草分别作为碳源获得的纤维素酶活性偏低，甘蔗渣能明显地提高Galactomycessp. CCZU11-1的CMC酶活。因此，碳源采用5 g/L甘蔗渣。

氮源也是一种重要的营养成分。采用 250 mL的三角瓶，装液量为100 mL，各种氮源[(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、酵母浸出液和牛肉膏]分别添加到无氮培养基（甘蔗渣5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH=5.0）中，其终浓度为5 g/L，结果如图3所示。这5种氮源对酶活均有影响，当以硫酸铵为氮源时，酶活最高，其次是氯化铵，以酵母浸出液为氮源时，体现的酶活较低，可能酵母膏对产酶有抑制作用。对于含有铵根离子的硫酸铵和氯化铵等无机氮源实验组来说，物质本身属于生理酸性物质，并且铵根离子可以直接被菌株同化为自身的氨基酸和蛋白质，是一类速效性氮源（相对于蛋白质这类迟效性氮源而言），有利于菌株生长，从而也促进了代谢产物的形成。文献报道硫酸铵也为绿色木霉 AS3.3711和突变黑曲霉的最适氮源[9-10]。综合考虑，本研究采用5 g/L硫酸铵为最适氮源。

图2 碳源对纤维素酶酶活的影响

图3 氮源对纤维素酶酶活的影响

2.2.2 培养温度、初始pH值及培养时间的影响

培养温度、初始pH值及培养时间对纤维素酶的活性起着重要的作用。25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃用于考察培养温度对纤维素酶酶活的影响。如图4（a）所示，在pH值为5的条件下，温度为30℃时菌体酶活较高，因此，最适培养温度为30 ℃。pH值为4.0～6.5时考察培养基初始pH值对菌体酶活的影响。如图4（b）所示，在温度30 ℃条件下，pH值为5.5时菌体产酶酶活较高，因此，pH值为5.5是Galactomycessp. CCZU11-1最适培养初始pH值。

图4 温度和pH值对纤维素酶酶活的影响

图5 培养时间对纤维素酶酶活的影响

在最适培养碳源、氮源、温度和pH值条件下进行Galactomycessp. CCZU11-1的培养，在培养5～9天后取样进行活性分析。如图5可知，随着发酵时间的增加，培养至7天时，FPA和CMCase达到最高值为11.3 IU/mL和18.2 IU/mL，然后逐渐降低，可能是酶蛋白被菌体自身分泌的蛋白酶降解所致[11]。所以，综合考虑，Galactomycessp. CCZU11-1最适产酶培养时间为7天。

2.3 Tween-80对酶活的影响

表面活性剂可增加细胞膜的通透性，减少酶在膜上的吸附量，进而提高胞外酶的产量。许多文献报道表面活性剂 Tween-80可作为添加剂提高纤维素酶活力[8-10，12]。本研究将不同质量比的Tween-80添加到100 mL优化的培养基中，研究Tween-80添加量对地霉菌产纤维素酶的影响。实验结果如图6所示，添加表面活性剂 Tween-80能提高纤维素酶活力，当加入量在0～8 g/L时，酶活增强，添加量为8 g/L时CMCase达到最大值24.6 IU/mL；当加入量超过8 g/L时，酶活急剧下降；添加量为10 g/L时CMCase活力为19.0 IU/mL，可能由于表面活性剂加入过多会引起蛋白质变性，进而使酶活力降低。因此，添加表面活性剂Tween-80为8 g/L。

在优化培养基体系中培养CCZU11-1 2 天后，分别加入0～200 g/L的NMMO，继续培养到7 天，结果如图7所示。由图7可见，未添加NMMO体系（空白对照）中，FPA和CMCase分别为13.5 IU/mL和24.6 IU/mL。在添加10 g/L和50 g/L的NMMO体系中，FPA分别为 10.5 IU/mL和 8.3 IU/mL，CMCase分别为19.5 IU/mL和16.2 IU/mL。很明显，Galactomycessp. CCZU11-1对NMMO具有较高的耐受性，含高浓度NMMO（200 g/L）的培养体系中，FPA和CMCase仍能保持明显的活性。目前，少有报道具有耐NMMO的纤维素酶产生菌，而本研究首次报道了筛选获得的Galactomycessp. CCZU11-1及其纤维素酶具有较高的NMMO耐受性。

2.3 发酵液糖化甘蔗渣进程

图6 不同浓度的Tween-80的纤维素酶酶活

图7 不同浓度NMMO对纤维素酶酶活的影响

图8 发酵液糖化甘蔗渣进程

如图8所示，分别在含200 g/L NMMO和不含NMMO的体系中，利用发酵液糖化甘蔗渣，还原糖浓度分别为0.60 g/L和0.63 g/L。在200 g/L NMMO存在条件下，Galactomycessp. CCZU11-1纤维素酶仍保持较好的活性及糖化率，表明Galactomycessp.CCZU11-1纤维素酶具有较好的NMMO耐受性，可在 NMMO-缓冲溶液体系中实现纤维素原料的原位酶解。

3 结 论

在常规筛选纤维素酶方法的基础上，在富集培养基中加入10 g/L NMMO，从土壤中筛选获得一株耐NMMO的高活性纤维素酶菌株Galactomycessp.CCZU11-1。经过发酵优化，最终获得了最适产酶培养条件。另外，分别在有NMMO和无NMMO的体系中糖化甘蔗渣，结果表明Galactomycessp.CCZU11-1纤维素酶对NMMO具有较好的耐受性，该菌及其纤维素酶在高效糖化纤维素原料中有着潜在的应用价值。

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